Диссертация (1150288), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Для этого к реакционной смеси (550 мкл), содержащей плазму крови сдобавкой цисплатина и раствор ДДТК, добавляли 2 мл CH3CN, перемешивали дляболее полного осаждения белков и центрифугировали. После этого надосадочнуюжидкость отбирали и выпаривали под током азота. К остатку добавляли 1 млводы, и эту пробу подвергали сорбционному концентрированию на картриджах сгидрофильно-липофильным сорбентом Waters Oasis HLB. Опробованы различныеварианты элюирующих систем: CH3CN, CH3OH, 2% H3CCOOH и CНCl3 (споследующим выпариванием и перерастворением в ацетонитриле).Лучшие результаты по извлечению получены при промывке сорбента50%-ым раствором CH3OH и последующем элюировании раствором ацетонитриласдобавкой2%-огорастворауксуснойкислоты.Степеньизвлечениядвухлигандного комплекса при этом составила 81±6%.Для оценки матричного эффекта проведена пробоподготовка шестиобразцов плазмы крови различных доноров с добавкой цисплатина по описаннойвыше схеме.
Анализ этих образцов обнаружил присутствие значительногоматричного эффекта, что проявилось в высоких значениях коэффициентавариации при оценке матричных факторов для шести проанализированныхобразцов (табл. 13).91Таблица 13. Значения матричных факторов для 6 образцов плазмыкрови различных доноров при определении цисплатина в формекомплекса Pt(DDTC)2№ образцаMFОбразец 10.52Образец 20.90Образец 30.44Образец 40.41Образец 50.98Образец 60.89MF (среднее)CV, %0.69±0.2638Для решения данной проблемы необходимо было усовершенствоватьпроцедуру получения комплекса. При анализе реакционной смеси послепроведения дериватизации на водных растворах в масс-спектре в режимесканирования m/z 295 – 650 был обнаружен сигнал m/z 639,2, которыйпотенциально мог соответствовать трехлигандному комплексу платины идиэтилдитиокарбамата состава Pt(DDTC)3+.
Анализ литературных данныхпоказал, что в [129] есть упоминание о получении комплекса такого состава.Подтверждение состава комплекса проведено с использованием тандемногомасс-спектрометрического анализа на хромато-масс-спектрометре Shimadzu ITTOF. Показано, что изотопное распределение для полученного нами комплексасовпадает с литературным (рис. 38). Кроме того, состав комплекса подтвердилсясигналами, наблюдаемыми в масс-спектрах второго и третьего порядков.92(а)Inten.
(x1,000,000)3.25639.9(1)(б)638.9(1)3.002.752.50637.9(1)2.252.001.751.50640.9(1)641.9(1)1.251.000.750.50642.90.25636.9(3)640.4(7)640.3(1)639.3(1)639.4(4)639.4(8)640.1(2)639.7(8)640.0637.0638.0639.0642.0m/z638.6(4)639.6(4)638.1(4)639.1(4)640.7(7)638.4(4)641.4(5)640.7(2)640.6(2)641.3(1)642.4638.8(10)641.1(2)642.7(8)641.76424(8)6416(5)6418(5)6426423(1)6417(2)6426(8)6414564045(7) 641.06412(5)6366362(3)640 2(2)6426(2) 86368(7)6406376377(10)6(8)6377(10) 638.3(1)6368 63763723(3)638638.7(10)6(10)6367(7)6375(10)6(3)64256426364(7)6(3)16376375(10)639 639.7(2)56416365(7)64201(2)Рис.38. Вид литературного [129] (а) и экспериментального (б)изотопного распределения в комплексе Pt(DDTC)3+.Так, в масс-спектре первого порядка детектируется ион m/z 638,9(Pt(DDTC)3+), который в МС/МС режиме фрагментируется с образованиемосколка m/z 490,9, соответствующего фрагменту Pt(DDTC)2 (Рис.39, А).Спектр на рис.
39, Б дает информацию о более глубокой – МС/МС/МС –фрагментацииионаm/z 490,9.Внёмсигналm/z 343,9соответствуетпротонированному остатку после отрыва ещё одного лиганда ДДТК, т.е.93[Pt(DDTC)+H]+, а сигнал m/z 419,8 характеризует протонированный осколок послепотери фрагмента N(C2H5)2.A (МС)490,92Б (МС)419,93343,9Рис.39. МС/МС-спектры ионов m/z 638,9 (А) и m/z 490,9 (Б).Таким образом, используя данные тандемной масс-спектрометрии, удалосьпредположить строение комплекса Pt(DDTC)3+ (рис.40).
Атом платины (IV)окружен тремя лигандами ДДТК таким образом, что атомы серы составляютнепосредственное окружение платины. Причем три из шести связей платина-сера– ковалентные, а три другие – координационные.94Рис.40.Pt(DDTC)3+.ПредполагаемаяпространственнаяструктуракомплексаПредположительно образование трехлигандного комплекса протекает последующей схеме:2PtCl2(NH3)2 + 6Na(DDTC) + 2H2O + O22Pt(DDTC)3+ OH- + 2NaOH + 4NH3 + 4NaClОсновываясь на полученных ранее данных по определению двухлигандногокомплекса, осуществили поиск наиболее подходящих хроматографических имасс-спектрометрических условий (табл.
14.) определения цисплатина в видекомплекса Pt(DDTC)3+.95Таблица 14. Найденные значения параметров ионизации приопределении цисплатина в форме комплекса Pt(DDTC)3+ПараметрЗначениеФрагментор, В100Напряжение на капилляре, В2200Температура осушающего газа, ºС300Режим SIM639,2При подборе состава подвижной фазы для определения комплексаPt(DDTC)3+ установлено:- использование ацетонитрила в качестве органического компонентаподвижной фазы более предпочтительно, чем метанола, поскольку дляпоследнего в масс-спектре наблюдается высокий уровень шума и мешающиесигналы в требуемом диапазоне масс;- увеличение концентрации уксусной кислоты в подвижной фазе приводит кувеличению площади хроматографического пика аналита и достигает стабильногозначения при содержании 0,5% (Рис.41);Рис.41.
Зависимость площади хроматографического пика комплексаPt(DDTC)3+ от содержания уксусной кислоты в составе подвижной фазы.96- увеличение концентрации ацетата аммония в составе подвижной фазы(80% CH3CN, 0,2% HCOOH) в диапазоне 2 – 15 мМ приводит к увеличениюплощади хроматографического пика; при этом время удерживания не меняется исоставляет 5,7 мин (рис.42).Рис.42.
Зависимость площади хроматографического пика комплексаPt(DDTC)3+ от содержания ацетата аммония в составе подвижной фазы.Изучено влияние на хроматографические характеристики пика аналитаподвижной фазы с добавкой аммонийно-ацетатного буфера в концентрации15 мМ при различных значениях рН (3 – 5). Установлено, что при значении рН 4.0интенсивность сигнала сохраняется, а отклик от примесей минимален.Попытки увеличить селективность разделения примесных компонентов икомплекса платины с ДДТК за счет снижения процентного содержанияорганического компонента (CH3CN) в составе подвижной фазы до 75% привели кизменению времен удерживания только примесей. В связи с этим было приняторешение, напротив, увеличить содержание ацетонитрила в элюирующей системедо 85%; примесные компоненты элюируются до 4 мин, а время удерживаниякомплекса цисплатина остается 5,7 мин.Поскольку хроматографический пик определяемого комплекса оставалсявсе-таки довольно широким, увеличили скорость потока подвижной фазы со 150до 300 мкл/мин.
Таким образом, удалось сократить время выхода всех97компонентов пробы (tR[Pt(DDTC)3+]=4,4 мин), а также уменьшить ширинухроматографического пика аналита (рис.43).Найденные хроматографические условия определения цисплатина в формекомплекса платины с ДДТК следующие: Колонка – REPROSYL-PUR C18-AQ, П.ф. – 85 % CH3CN, 15 мМ H3CCOONH4 (рН 4,0), Скорость потока – 300 мкл/мин, Объем пробы – 10 мкл.MSD1 TIC, MS File (P2414100.D)API-ES, Pos, SIM, Frag: 100160001400012000100008000600040002000123456Рис.43. Хроматограмма пробы комплекса Pt(DDTC)3+выбранных хроматографических условиях определения.Приотработкепроцедурыдериватизациицисплатинаminприварьироваликонцентрацию раствора реагента ДДТК (5-50%) в 0,2М NaOH; соотношениеобъемов раствора цисплатина и раствора реагента; температуру (20 – 50ºС) ивремя (20 – 70 мин) реакции.
При выборе соотношения объемов учитывали, чтообъём плазмы крови образца целевых исследований должен составлять не более500 мкл.Лучшим соотношением объемов раствора цисплатина и раствора ДДТК в0,2 М раствора NaOH, при котором хроматографические характеристики пика98аналита максимальны, а влияние примесных компонентов минимально, оказалосьсоотношение 1 : 1 (объемн.), а концентрация раствора реагента – 25% (рис.44).MSD1 TIC, MS File (P2414142.D)MSD1 TIC, MS File (P2414144.D)MSD1 TIC, MS File (P2414148.D)API-ES, Pos, SIM, Frag: 100API-ES, Pos, SIM, Frag: 100API-ES, Pos, SIM, Frag: 1003500030% DDTC300002500025% DDTC200001500020% DDTC100005000123456minРис. 44.
Влияние концентрации ДДТК в растворе на площадьхроматографического пика образующегося комплексаУсловия: хромато-масс-спектрометр Agilent 1100, колонка REPROSYL-PURC18-AQ, п.ф. 85% CH3CN, 15мМ аммонийно-ацетатный буфер (рН 4), скорость потока300 мкл/мин, объем ввода 10 мкл, SIM: 639,2.Выявленовлияниетемпературыивремениреакциинаплощадьхроматографического сигнала (рис.45). Так при проведении реакции прикомнатной температуре (25ºС) достигнутые площади пика аналита былисущественно ниже, чем при 45ºС. Однако уже при 50ºС через 30 минут начиналсяпроцесс разрушения комплекса Pt(DDTC)3+, о чем свидетельствует снижениезначений площади пика аналита.
Установлено, что наиболее подходящимявляется сочетание времени и температуры реакции – 45ºС и 50 мин.99Рис.45. Зависимость площади хроматографического сигналакомплекса Pt(DDTC)3+ от времени реакции при различных температурах.Дляизвлечениявоспользовалисьтрехлигандногоразработаннойранеекомплексасхемойизплазмыпроцедурыкровисорбционногоконцентрирования. Степень извлечения в данном случае вычисляли по формуле:RS аналита _ после _ ТФЭS стандарта100%(4)Для ТФЭ комплекса Pt(DDTC)3+ использовали сорбционные патроны WatersOASIS HLB.Осуществлен подбор растворителя для промывки сорбента (H2O, 10% и 50%CH3OH) и элюирования аналита (CH3CN, CH3CN с добавкой 2% H3CCOOH,HCCl3).В результате остановились на следующей схеме экстракции:Кондиционирование сорбента 1 мл CH3OH/1 мл H2OЗагрузка пробыПромывка 2 мл H2OЭлюирование 2 мл CH3OHВыпаривание метанола в токе азота100Перерастворение сухого остатка в 500 мкл CH3CN с добавкой2% H3CCOOH.Степень извлечения комплекса составила 92±3 %.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
