Диссертация (1150288), страница 15
Текст из файла (страница 15)
50. Структурные формулы капецитабина (1) и 5-фторурацила (2)и их внутренних стандартов – капецитабина-d11 (3) и 5-бромурацила (4).Первоначально для совместного определения капецитабина и 5-фторурацилаиспользовали в качестве процедуры пробоподготовки осаждение белков.Опробованыразличныеагентыдляосаждения(метанол,ацетонитрил,трихлоруксусная кислота) и соотношения объемов плазмы и осаждающего агента.Однако при масс-спектрометрическом анализе образца плазмы крови после109пробоподготовки с добавкой капецитабина и 5-фторурацила наблюдалось оченьсильное подавление ионизации вплоть до полного отсутствия отклика аналита(MF→0).Для снижения такого матричного влияния испытаны различные экстрагентыдля жидкостно-жидкостной экстракции, а также комбинации процессов ЖЖЭ,осаждения белков, сорбционного концентрирования.
Наименьшее подавлениеионизации и наибольшие степени извлечения наблюдались при использовании вкачестве экстрагента этилацетата с предварительным подкислением образцаплазмы крови. Кроме того, следует отметить, что ни один из опробованныхсорбентов (гидрофобный, катионообменный, анионообменный, гидрофильнолипофильный) не позволил одновременно полностью удержать и капецитабин, и5-фторурацил при загрузке образца.Таким образом, ЖЖЭ в этилацетатстановилась единственно возможным вариантом извлечения аналитов из плазмыкрови с приемлемыми степенями извлечения: 60±8% для капецитабина и 47±4%для 5-фторурацила.Эксперименты по использованию сверхсшитого полистирола Purosep 200 присорбционном концентрировании показали наилучшие результаты: матричноевлияние не проявлялось ни гашением ионизации, ни высоким коэффициентомвариаций матричного фактора для образцов плазмы крови различных доноров.Перед загрузкой на сорбент доводили значение рН образца крови до 6,5добавлением 1М HCl.
Это требовалось для перевода аналитов в незаряженнуюформу (pKa для капецитабина и 5-фторурацила составляет 8.2 и 7.7соответственно). В серии предварительных экспериментов опробованы различныеэлюирующие системы (метанол, ацетонитрил, эти же растворители с добавкойводного раствора аммиака). Извлечение аналитов из плазмы крови с применениемсверхсшитого полистирола Purosep 200 осуществляли по следующей схеме:110Кондиционирование1 мл метанола 1 мл водыЗагрузка пробыплазма крови (рН 6.5) 1М‐ный раствор HCl Промывка1 мл водыЭлюирование5%‐ный раствор аммиака в ацетонитриле Выпаривание~30 мин в токе N2, 30°С Растворение и анализ500 мкл водыДостигнутые степени извлечения аналитов оказались более высокими, чем вслучае ЖЖЭ: 98±2% для капецитабина и 84±1% для 5-фторурацила.
Кроме того,значения коэффициентов вариации для 12 образцов плазмы крови различныхдоноров оказались гораздо ниже в случае сверхсшитого полистирола (табл.17).Таблица 17. Сопоставление коэффициентов вариации матричныхфакторов при жидкостной экстракции и сорбционном концентрировании насверхсшитом полистироле на примере капецитабина и 5-фторурацилаАналитКапецитабин5-фторурацилКоэффициент вариации CV, % (n=12)Жидкостная экстракция (этилацетат)ТФЭ (ССП)13,20,98,41,5Однако применение сверхсшитого полистирола Purosep 200 при проведенииисследования биоэквивалентности оказалось невозможным из-за необходимостиручной набивки сорбционных патронов для экстракции.
При количестве более1500 образцов плазмы крови для исследования биоэквивалентности этотнедостаток оказывался критичным. Поэтому выбор был сделан в пользу ЖЖЭэтилацетатом.111ГЛАВА IV. ВЫЯВЛЕНИЕ И НИВЕЛИРОВАНИЕ МАТРИЧНОГОВЛИЯНИЯ, ВЫЗЫВАЮЩЕГО НАРУШЕНИЕ ЛИНЕЙНОСТИГРАДУИРОВОЧНОЙ ЗАВИСИМОСТИIV.1. Матричный эффект при определении циклосерина в плазмекровиМешающее влияние матричных компонентов может проявляться не тольков неудовлетворительной воспроизводимости результатов.
Так, при разработкеметодики определения противотуберкулезного препарата циклосерина (рис. 51) вплазме крови обнаружен эффект нарушения линейности градуировочнойзависимости на высокихконцентрационныхуровнях.Следуетподчеркнуть, что это небыло вызвано перегрузкойколонкиилиподобнымидругимипричинами.ДанныйпроявлялсяСтруктура циклосеринаСтруктура ниацинаэффектименноРис. 51.
Строение циклосерина и ниацинадля (внутренний стандарт).образцов плазмы крови, в то время как для водных стандартных растворовлинейность градуировки не нарушалась.В литературе имеется крайне мало работ, посвященных определениюциклосерина в биологических жидкостях [132, 133]. Это, в первую очередь,обусловлено высокой полярностью молекулы циклосерина и, как следствие,сложностью применения обращенно-фазовой ВЭЖХ для его определения.При разработке процедуры извлечения циклосерина из плазмы кровиопробованыразличныеацетонитрилом,вариантыпробоподготовки:жидкостно-жидкостнаяэкстракцияосаждениеибелковсорбционное112концентрирование.
В серии предварительных экспериментов использованыразличные элюирующие системы (метанол, ацетонитрил, их смесь с добавкамиуксусной кислоты и водного раствора аммиака) и сорбционные материалы. Вслучаях осаждения белков и жидкостно-жидкостной экстракции основнымипроблемами явились недостаточная селективность разделения и низкие степениизвлечения. По этим же причинам не подошли такие сорбенты как C18 и слабыйкатионит Oasis WCX.В конечном итоге, предпочтение было отдано процедуре сорбционногоконцентрированияпредставляетнакатионообменномсобойполимерсосорбентесмешаннойOasisMCX,которыйобращенно-фазовойикатионообменной функциональностью (рис.52).Наповерхностикатионообменныеизбирательностьполимерногосульфо-группы,косновнымсорбентакоторыевеществам.расположеныпозволяютПрисильныеемупроявлятьразработкепроцедурысорбционного концентрирования циклосерина из плазмы крови мы столкнулись спроблемой: не удавалось получить удовлетворительные степени извлеченияаналита с этого сорбента.В серии предварительных экспериментов с водными стандартнымирастворами показано, что это,вероятно,сильнымивызванодостаточновзаимодействиямимолекул аналита с сорбентом.Элюировать аналит не удавалосьниоднойизопробованныхэлюирующих систем (5%, 8%,15% раствор аммиака в метанолеи в ацетонитриле, табл.18).Рис.52.
Строение сорбента OasisMCX.113Таблица 18. Степени извлечения при использовании различныхэлюирующих системЭлюирующая системаCH3OHCH3OH + 5% NH3·H2OCH3OH + 8% NH3·H2OCH3OH + 15% NH3·H2OCH3CNCH3CN + 5% NH3·H2OCH3CN + 8% NH3·H2OCH3CN + 15% NH3·H2OСтепень извлечения, %1,8±0,19,0±0,110,4±0,611,8±0,10,9±0,28,0±0,58,5±0,110,5±0,3Для решения проблемы применен прием дезактивации функциональныхгрупп[134].ПризагрузкеобразцаприpH<3молекулыциклосеринавзаимодействуют с катионообменным сорбентом за счёт наличия в молекулекатионных центров (pKa циклосерина и ниацина составляет 4.2 и 4.8соответственно). При элюировании с сорбента смывается лишь незначительнаячасть молекул аналита, либо не смывается вовсе ничего из-за большогоколичества свободных функциональных SO3¯ -групп. Как следствие – невысокиестепени извлечения (Рис.53, а).Если перед загрузкой образца пропустить через сорбент аммонийноформиатный буфер, ионы аммония NH4+ будут причиной частичного переводасорбента в аммонийную форму (Рис.53, б).
При последующей загрузке образцамолекулы циклосерина взаимодействуют лишь с остаточными SO3¯ - группами,не перешедшими в аммонийную форму. При элюировании раствором аммиака вметаноле молекулы аналита не удерживаются на сорбенте и вытесняются ионамиаммония. Таким образом удаётся значительно повысить степень извлечения.Подобный прием эффективен и прост в случае, когда не удается элюироватьаналит из-за его прочного связывания с сорбентом.114(а)(б)SO3¯ CYCCYC SO3¯SO3¯NH4+NH4+SO3¯SO3¯ CYCCYC SO3¯SO3¯NH4+NH4+SO3¯SO3¯SO3¯SO3¯NH4+NH4+SO3¯SO3¯SO3¯SO3¯NH4+NH4+SO3¯SO3¯SO3¯SO3¯NH4+NH4+SO3¯SO3¯SO3¯SO3¯ CYCCYC SO3¯SO3¯SO3¯SO3¯ CYCCYC SO3¯Рис. 53.
Схематичное изображение взаимодействие молекул циклосерина скатионообменным сорбентом Oasis MCX без предварительного переводасорбента в аммонийную форму (а) и с проведением этой процедуры передзагрузкой образца (б).Условные обозначения:SO3¯– группа SO3¯;NH4+– ион аммония NH4+;CYC – молекула циклосеринаУстановлено, что на степень извлечения можно влиять путем измененияконцентрации буферного раствора (рис.54) или его природы (формиат и ацетатаммония, например).Если концентрация буфера мала (10 мМ раствор), остается многодоступныхфункциональныхгруппдлявзаимодействиясмолекуламициклосерина.Если же концентрация буфера слишком велика (1М раствор), ионы аммониязанимают все SO3¯ - группы, и при загрузке образца молекулы аналита незадержатся на сорбенте.115Рис.54.
Влияние концентрации формиатно-аммонийного буфера настепень извлечения циклосерина из плазмы крови.Наиболее подходящим является промежуточный вариант. В данном случаепри определении циклосерина экспериментально было установлено, чтоприменение 100 мМ формиатно-аммонийного буфера и использование 5%-огораствора аммиака в метаноле в качестве элюирующей системы позволяет внесколько раз увеличить степень извлечения циклосерина (табл.19).Таблица 19.
Сравнение степеней извлечения (%) циклосерина изплазмы крови (n=10) при сорбционном концентрировании на сорбентеOasis MCX с использованием приема дезактивации функциональных группи без негоСтепень извлечения, %ИтоговаяциклосеринаБез переводасорбента ваммонийную форму9,0±0,1С предварительнымпереводом сорбента ваммонийную форму77±2схемапробоподготовкиплазмывыглядитследующимобразом:кондиционировалиметаноломикровидлясорбентформиатно-аммонийнымопределенияOasisбуфером,MCXзатемзагружали образец плазмы крови, в который добавлен тот же буфер и муравьиная116кислота для достижения необходимого значения рН (2.5). После загрузки пробысорбент промывали водой и раствором соляной кислоты.Элюировали циклосерин и внутренний стандарт раствором аммиака вметаноле. Элюат выпаривали в токе азота, после чего сухой остаток растворяли всмеси метанола и пропанола-2 с добавкой трифторуксусной кислоты.Специальныйблокэкспериментовпосвященпоискуусловийхроматографического определения циклосерина.
Проведенные предварительнохроматографическиеэкспериментынаобращенно-фазовыхиразличныхмодифицированных сорбентах (табл. 20) не привели к удовлетворительнымрезультатам из-за отсутствия взаимодействий аналита с сорбентом внезависимости от используемых добавок в состав подвижной фазы.Таблица 20. Опробованные хроматографические колонки приопределении циклосерина в плазме кровиНазвание колонкиYMС-Triart C18YMC-Pack ODS-AQReproSil-Pur C18-AQAtlantis dC18Характеристики100×2.1 mm, 3 μm100×2.0 mm, 3 µm150×2 mm, 3 µm100×2.1 mm, 3 µmИспользование режима HILIC (Hydrophilic interaction liquid chromatography)– с разделением по механизму с полярными взаимодействиями – обеспечилодостижение требуемого результата.
Суть механизма данного режима изображенана рис. 55. В качестве стационарной фазы используется силикагель. Еслиподвижная фаза содержит большую долю воды (например, более 40%, объемн.),то взаимодействия полярных молекул с сорбентом ослаблены, поскольку имеетместо конкуренция между молекулами воды и аналита за сорбционные центрысиликагеля; в случае же, когда вода составляет лишь несколько процентов отсостава подвижной фазы, взаимодействия между полярной молекулой аналита исорбентомусиливаются.Этопозволяетуправлятьхроматографическим117поведением,например,такойполярноймолекулыкакциклосерин.– полярный компонентРис.55. Механизм хроматографического режима HILIC.Первоначально в качестве подвижной фазы использовали смесь метанола иводы с добавкой трифторуксусной кислоты, однако время удерживанияциклосерина было слишком большим (>10 мин).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
