Диссертация (1150288), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Эндогенные компоненты биологическойматрицы (фосфолипиды, белки и др.) также элюируются из хроматографическойколонки и вносят изменения в отклик от вводимого аналита, что проявляется вподавлении или увеличении аналитического сигнала [50]. В таком случаеневозможно количественно оценить влияние матричного эффекта. При этом еслиодним итем жеметодом определяютсясразунесколькосоединений,соответствующие стандарты должны быть независимо введены в массспектрометр с целью изучения возможного матричного эффекта для каждогоопределяемого компонента. В случае варианта пост-экстракционной добавки(рис. 13.) матричный эффект количественно оценивается путем сравнения откликаопределяемого соединения в чистом растворителе с соответствующим откликомтого же соединения, добавленного в образец биологической матрицы послепроцедуры ее пробоподготовки [52].В работе [53] понятие «абсолютный матричный эффект» определено какотношение аналитического сигнала определяемого соединения в образцеэкстракта биологической матрицы к отклику аналита в чистом растворителе.Однако, зачастую гораздо важнее знание относительного матричного эффекта,который определяется как матричный эффект между различными источникамибиологической матрицы [53].
При этом он должен быть изучен на образцахбиологической жидкости не менее, чем из шести различных источников. Вкачествекритерияоценкиотносительногоматричногоэффектаобычноиспользуют точность между наклонами градуировочных кривых, полученных прииспользовании биологической матрицы из пяти различных источников. Принятосчитать, что метод практически не обременен этим эффектом, если относительноестандартное отклонение не превышает 3-4% [49].30биологическая матрица послепробоподготовкидобавка аналитаВЭЖХнасосУстройствовводаИонныйисточникКолонкаМС/МС%, интенсивностьВремя (мин)Рис.13. Схематичное изображение метода пост-экстракционнойдобавки, используемого для оценки матричного эффекта. Пунктирнойлинией обозначен сигнал определяемого компонента в чистомрастворителе.
Сплошная линия отражает отклик определяемогокомпонента, добавленного в биологическую матрицу после еепробоподготовки. Уменьшение площади пика говорит о подавленииионизации [51].I.3.2. Способы снижения и устранения матричного эффектаI.3.2.1. Выбор способа пробоподготовки биообъектов к анализуМатричный эффект часто непосредственно связан с недостаточнойочисткой исследуемого биологического образца.
При этом уменьшение объемавводимойпробыилиразбавлениеобразцаможетрезкосказатьсяначувствительности метода [41, 54]. Таким образом, оптимизация процедурыочистки образца имеет первостепенное значение.31Наиболее простой и быстрый способ пробоподготовки биологическогообъекта – осаждение белков. Однако в этом случае полностью освободиться отматричного эффекта не удается. При анализе биологических образцов послепроцедуры осаждения белков может наблюдаться ионная супрессия, посколькуэтотпутьнепозволяетэффективноудалятьэндогенныекомпонентыбиологической матрицы (липиды, фосфолипиды, жирные кислоты и др.).Коэлюирование таких соединений с определяемым компонентом влияет напроцесс десольватации капель электроспрея [50, 52].Элюаты, получаемые с использованием сорбционного концентрирования(ТФЭ), значительно чище.
Это продемонстрировано в [54] на примере препаратаатазанавира.Напослеколоночномрис.14сравниваютсявведении,полученныехроматограммыспомощьюэкстрактовразныхприспособовпробоподготовки. Видно, что для осаждения белков (А) наблюдается подавлениесигнала на времени удерживания аналита (1,36 мин). В случае сорбционногоконцентрирования (Б) такого подавления нет.В [37] обсуждается влияние способа пробоподготовки и природыбиологического объекта на матричный эффект при количественном хромато-массспектрометрическом анализе лекарственных препаратов с использованием методапост-колоночного введения биологической матрицы, подготовленной к анализу,на примере морфина.
Три вида биологических жидкостей (моча, слюна и плазмакрови) были подвергнуты процедуре осаждения белков и ТФЭ.Установлено, что рассмотренные варианты подготовки пробы к анализумогут приводить как к уменьшению, так и к росту матричного эффекта [37].В [55] при определении лекарственного препарата пипераквина в плазмекрови обнаружено, что матричный эффект, наблюдаемый после проведения ТФЭ,в большей степени отвечает за подавление ионизации, чем фоновый шум плазмы.Остатки солей от буферных систем, используемых в ТФЭ, подавляли сигнал какпипераквина, так и его дейтерированного внутреннего стандарта.
Однако это неотразилось на количественном определении пипераквина.32(А)Интенсивность, %АтазанавирВремя, мин(Б)Интенсивность, %АтазанавирВремя, минРис.14. Хроматограммы экстрактов плазмы крови при постколоночном введении, полученных в результате осаждения белковацетонитрилом (А) и сорбционного концентрирования на сорбентеLiChrosep Sequence (Б) с наложением хроматограммы атазанавира наверхнем уровне концентрации [54].С другой стороны, следы триэтиламина, оставшиеся после выпариванияэлюата, полученного в условиях ТФЭ, явились источником подавления сигналадля обоих определяемых соединений. Дейтерированный внутренний стандарт,являясь менее липофильным, чем аналит, элюировался раньше. Показано, чтоиспользование внутреннего стандарта, меченого стабильным изотопом, некомпенсирует матричный эффект, если в образце присутствует триэтиламин, идаже может привести к отклонению от истинной концентрации до 50 %.33Следовательно, его необходимо тщательно удалять перед перерастворениемобразца [55].В [52] проведено сравнение различных способов пробоподготовки плазмыкрови по чистоте получаемого экстракта, величине матричного эффекта и степениизвлечения требуемых аналитов.
Показано, что ацетонитрил является болеепредпочтительным органическим растворителем для осаждения белков, чемметанол. Однако процедура осаждения белков приводит к значительномуподавлению ионизации для большинства соединений. Использование обращеннофазовой или катионообменной ТФЭ привело к заметному снижению содержанияфосфолипидов – основного источника матричного эффекта [52].Наиболееэффективнымвариантомпробоподготовкиявиласькатионообменная ТФЭ смешанного типа, сочетающая обращенно-фазовый иионообменный механизмы удерживания, что позволяет достигать высокихстепенейизвлечения(>90%)полярныхинеполярныхсоединенийприминимальном значении матричного эффекта.Применение жидкостно-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) также обеспечилополучение экстрактов, практически не содержащих мешающих компонентов,однако в большинстве случаев степень извлечения полярных аналитов невелика.Существуют и другие способы пробоподготовки, например, микродиализ,основанный на принципе диализа через полупроницаемые мембраны.
Подобныеметодики подготовки анализируемых образцов in vivo используются для контролясостава внеклеточной жидкости в различных тканях организма [51] и позволяютизвлекать гидрофильные эндо- и экзогенные соединения (нейротрансмиттеры,пептиды,остаточныелекарственныепрепараты).Несмотрянато,чтомикродиализат представляет собой безбелковый водный раствор, в нем можетсодержаться большое количество солей (>150 мМ), вызывающих подавлениеионизации определяемых компонентов [56].Известно, что оптимизация условий хроматографического анализа (выборусловий градиентного элюирования, рН и состава подвижной фазы) позволяетсущественно влиять на селективность разделения.34В [52] изучена зависимость матричного эффекта от кислотности подвижнойфазы при определении фосфолипидов.
Показано, что использование быстрогоградиентного элюирования способствует повышению влияния матричногоэффекта: ухудшается хроматографическое разделение определяемых соединенийи эндогенных компонентов биологических сред. Еще один возможный способустранения матричного эффекта – использование жидкостной хроматографии сучастием гидрофильных взаимодействий (HILIC, hydrophilic-interaction liquidchromatography). Подобный режим сочетает использование силикагеля илиполярных стационарных фаз с элюентами с высоким содержанием органическихрастворителей, что делает его весьма востребованным при определении полярныхсоединений в биологических объектах [57] и способствует устранениюматричного эффекта в большей степени, чем применение обращенно-фазовогорежима [38].I.3.2.2.
Выбор масс-спектрометрических условийСогласно публикациям [45, 49, 58] масс-спектрометрия с химическойионизацией при атмосферном давлении менее восприимчива к матричномуэффекту, чем с электрораспылительной ионизацией. Так, в [58] на примереметадона продемонстрировано значительное подавление ионизации при вводеобразца плазмы крови после осаждения белков и образца плазмы, разбавленного в2 раза водой (Рис.15, А). В случае введения тех же образцов в режиме химическойионизации при атмосферном давлении (Рис.15, Б) такого значительногопроявления влияния матрицы не наблюдалось. Тем не менее, эта проблемаполностью не исключена [37], [59].В [43] проведена сравнительная оценка обоих видов ионизации присовместном определении десяти соединений ряда амфетаминов в меконии.35Рис.15.
Сравнение электрораспылительной ионизации (А) и химическойионизации при атмосферном давлении (Б) в пост-колоночном режиме [58].Выбран метод химической ионизации при атмосферном давлении. Но дажепри использовании этого варианта ионного источника матричный эффектнаблюдался для большинства аналитов и внутренних стандартов на всехпротестированныхконцентрационныхуровнях,приэтомегозначенияправильности варьировались от 85,2 до 149,4%.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
