Диссертация (1150270), страница 18
Текст из файла (страница 18)
СЭМ и СТЭМ-изображения лиофильнойпленки на основе стабилизатора № 3 с добавкой 2.0 мг/мл БСА, котораяиммобилизирована на медной подложке, представлены на рис. 59 и 60соответственно.Рис. 59 СЭМ изображение иммобилизированных реактивов на основе стабилизатора № 3 сдобавкой 2 мг/мл БСА на медной подложке (общий вид).~ 124 ~Рис. 60 СТЭМ изображение иммобилизированных реактивов на основе стабилизатора № 3 сдобавкой 2 мг/мл БСА на медной подложке (общий вид).На представленных изображениях достаточно четко просматриваютсяагломераты ОТПЦР реактивов и компонентов раствора стабилизаторов.СТЭМ анализ лиофильной пленки проводили для оценки наличия тонкойструктуры иммобилизированных реагентов.
На изображении видно, что тонкаяструктура присутствует, но при этом невозможно оценить минимальные размерыэлементов тонкой структуры пленки. С данным разрешением можно ценитьтолько макроагломераты и их линейные размеры. Улучшение разрешения сталоневозможным вследствие нестабильности пленки ввиду ее быстрого прожиганияэлектронным пучком (рис. 61).Рис. 61 СТЭМ изображение иммобилизированных реактивов на основе стабилизатора № 3 сдобавкой 2 мг/мл БСА на медной подложке (общий вид).~ 125 ~СледующийзаключалсявэтаппроверкипроведенииэффективностиОТПЦРнастабилизациипартииферментовмикрочиповсиммобилизированными реактивами в течение 1–2 дней после лиофилизации. Приэтом все микрочипы хранились в холодильнике при +4 °С.
Полученныеусредненные пороговые циклы представлены в табл. 16.Таблица 16 Пороговые циклы ОТПЦР, проведенных с использованиемлиофилизированных реактивов после двух дней хранения при +4 °С (n = 7, P = 0.95)Раствор стабилизаторов№3Раствор стабилизаторов№2Пороговый циклПороговый цикл23.30 ± 0.0822.81 ± 0.130.223.15 ± 0.0423.36 ± 0.300.0224.04 ± 0.0623.55 ± 0.42ПЦР-смесь21.72 ± 0.0522.11 ± 0.10Концентрациядобавки раствораБСА, мг/мл2Следует отметить, что в случае основного стабилизатора № 3 кривые ПЦРдля одной пробы показывают очень небольшой разброс значений пороговогоцикла.
Усредненные ПЦР кривые представлены на рис. 62 и 63.Рис. 62 Усредненные ПЦР-кривые, полученные в ходе эксперимента с использованиемиммобилизированных реактивов. Раствор стабилизаторов № 3. 1 — ПЦР-смесь, 2 — добавкараствора БСА 2 мг/мл, 3 — добавка раствора БСА 0.2 мг/мл, 4 — добавка раствора БСА 0.02мг/мл.~ 126 ~Рис. 63. Усредненные ПЦР-кривые, полученные в ходе эксперимента с использованиемиммобилизированных реактивов. Раствор стабилизаторов № 2. 1 — ПЦР-смесь, 2 — добавкараствора БСА 2 мг/мл, 3 — добавка раствора БСА 0.2 мг/мл, 4 — добавка раствора БСА 0.02мг/мл.Из представленных результатов легко можно заметить, что при проведенииОТПЦРспомощьюиммобилизированныхреактивовинтенсивностьфлуоресценции значительно меньше аналогичного значения в случае жидкихреактивов.
Это объясняется разной концентрацией флуорофора. Так, припроведении ОТПЦР на жидких реактивах, объем растворафлуоресцентногозонда и праймеров составляет 2.4 мкл из расчета на один микрочип. В смесьреактивов, подготовленную для иммобилизации, помещается 3.6 мкл растворазонда ипраймеров, в соответствиис пропорцией, разработанной длялиофилизации ПЦР-реактивов (ДНК тест-системы). Увеличение количествафлуоресцентных зондов и остальных реактивов способствует тому, что эффектухудшения эффективности ПЦР с лиофилизированными реактивами за счетнеизбежного инактивирования части веществ сводится к минимуму.Рассмотрим, влияет ли концентрация основных стабилизаторов на ОТПЦР.При использовании раствора стабилизаторов № 3 не наблюдается явного различиямежду пороговым циклом и ходом кривых для растворов разных концентрацийБСА, что свидетельствует об одинаковом вкладе растворов БСА разнойконцентрации в эффективность стабилизации реактивов.~ 127 ~При проведении реакции с использованием реактивов, иммобилизированныхна микрочипах с раствором стабилизаторов № 2 наибольший аналитическийсигнал и минимальные пороговые циклы наблюдаются при добавлении раствораБСА 2 мг/мл.
Таким образом, на данном этапе исследования сделанпредварительный вывод, что такой состав стабилизаторов обладает лучшимизащитными свойствами для белков среди других модельных смесей. Тем неменее, эффективное сохранение биологической активности ферментов в течениедлительноговремениможет обуславливаться более концентрированнымирастворами. Таким образом, выбор в сторону той или иной концентрациираствора стабилизаторов и раствора БСА может быть сделан только послепроведения ОТПЦР на микрочипах, подвергшихся искусственному старению.V.4. Исследование эффективности стабилизации иммобилизированныхОТПЦР-реактивов в зависимости от времени храненияПроверкустабильностилиофилизированныхиОТПЦРсохраненияреагентовферментативнойнаповерхностиактивностиалюминиевыхмикрочипов проводились методом «ускоренного старения».
Согласно работе[158], методику ускоренного старения проводят при повышенной температуре сцелью установления или подтверждения срока годности биологически активныхвеществ. Суть метода заключается в выдерживании испытуемого лекарственногосредства при температурах, превышающих температуру его хранения. Приповышенныхтемпературах,ферментативныхсистемахкакправило,ускоряютсяфизико-химическиепроцессы,протекающиевприводящиесовременем к нежелательным изменениям свойств. В случае ОТПЦР к потереферментативной активности полимеразы и ревертазы при лиофилизации ипоследующемхраненииприводятреакциидезаминирования,гидролиза,конформационные изменения при образовании новых пептидных связей,следствием которых является денатурация самих ферментов и ингибирование~ 128 ~реакции в целом.
Следует отметить, что именно ревертаза быстрее всего теряетбиологическую активность в процессе лиофилизации, что было доказаноэкспериментами, аналогичными описанным в разделе IV: ОТПЦР проводили намикрочипах, часть ячеек которых содержала иммобилизированный реагент, а вдругую часть реактив добавляли вместе с пробой перед анализом.Таким образом, при повышенной температуре промежуток времени, втечение которого контролируемый показатель качества лиофилизированныхреагентов–пороговыйцикл,сохраняетсявдопустимыхпределах(экспериментальный срок годности микрочипа), искусственно сокращается всравнении со сроком годности при температуре хранения.
Это позволяетзначительно сократить время, необходимое для установления срока годности.Срок годности С при заданной температуре хранения tхр. связан сэкспериментальным сроком годности СЭ при повышенной температуре храненияtэ следующей зависимостью:C K CЭ,t э t хр .где коэффициент соответствияKA10, А ― Температурный коэффициентскорости химической реакции (2.5). Приведенная зависимость основана направиле Вант-Гоффа о 2–4-кратном росте скоростей химических реакций приувеличении температуры на 10 °С. В табл. 17 приведены значения коэффициентовсоответствия K для различных значений разности температур ускоренного истандартного хранения при A = 2.5.Таблица 17 Значения коэффициентов соответствия К дл постановки экспериментов поускоренному старению активных веществ(tэ–tхр) °С101520253035K2.54.06.39.915.624.7Для определения срока годности микрочипов, температура хранения которыхв холодильнике составляет +4 °С, выбранная температура ускоренного храненияtэ, равная +35 °С.
Экспериментальный срок годности при 35 °С составил 6 суток.~ 129 ~Дляпроверкиэффективностистабилизирующегодействиярастворастабилизаторов по истечении определенных интервалов времени, два микрочипапартии, подвергающейся ускоренному старению, снимали с термостата ипроводили ОТПЦР, оценивая пороговые циклы. Полученные данные приведены втабл.
18 графики зависимостей порогового цикла от длительности старения длямикрочипов с иммобилизированными реактивамистабилизаторов№3представленынас использованием растворарис.64,длямикрочиповсиммобилизированными реактивами с использованием раствора стабилизаторов №2 – на рис. 65.Таблица 18. Пороговые циклы ОТПЦР в зависимости от срока хранения при повышенныхтемпературахПороговый циклРаствор стабилизаторовРаствор стабилизаторов№2№3ДлительностьБСА 2БСА 0.2БСАБСА 2БСА 0.2БСАстарения, днимг/млмг/мл0.02мг/млмг/мл0.02мг/млмг/мл021.7522.7122.6022.9124.1525.11123.6124.8925.3124.5326.6626.66226.1126.9427.5826.3229.4929.49328.2429.4630.4428.4433.1233.12430.0131.2332.0229.8235.0135.01531.2332.1433.5231.2636.4936.49632.2233.1834.8531.7438.1538.15~ 130 ~Рис. 64.
Графики зависимостей порогового цикла от старения для микрочипов симмобилизированными реактивами с использованием раствора стабилизаторов № 3. 1 –добавка раствора БСА 2 мг/мл, 2 – добавка раствора БСА 0.2 мг/мл, 3 – добавка раствора БСА0.02 мг/мл.абРис. 65. а) графики зависимостей порогового цикла от старения микрочипов симмобилизированными реактивами с использованием раствора стабилизаторов № 3. 1 –добавка раствора БСА 2 мг/мл, 2 – добавка раствора БСА 0.2 мг/мл, 3 – добавка раствора БСА0.02 мг/мл; б) экстраполированные с помощью логистической функции кривые на основеграфиков зависимости порогового цикла от старения микрочипов с иммобилизированнымиреактивами с использованием раствора стабилизаторов № 3По результатам испытаний все микрочипы, хранившиеся при температуре 35°С, позволили проводить качественный анализ методом ОТПЦР. Из полученныхданных видно, что наименьшие пороговые циклы наблюдаются при добавлении к~ 131 ~стабилизаторам раствора БСА 2 мг/мл, при этом, в течение исследуемого срокастарения, нет сильного различия в эффективности стабилизации реактивов прииспользовании раствора стабилизаторов № 2 или № 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
