Диссертация (1150270), страница 15
Текст из файла (страница 15)
Измерение контактного угла смачивания поверхности микрочиповводойПосле обработки алюминиевых пластин в плазме и синтезе на ихповерхностиуглеросодержщихпленокбольшойинтереспредставлялоисследовать гидрофильные свойства полученной поверхности ввиду того, что дляосуществления ОТПЦР капля внутри микрореактора обязательно должнарастекаться. На рис. 43 представлены результаты измерения контактного угла.а)б)в)Рис. 43 Результаты измерения краевого угла смачивания поверхности алюминиевыхмикрочипов водой: а) – необработанный алюминий; б) – обработка в плазме кислорода иаргона; в) – после всех стадий обработки.Таким образом, после синтеза пленки поверхность алюминия обладаетдостаточной мерой гидрофильности, сравнимой с очищенной и частичноокисленной поверхностью чистого металлического алюминия, полученныемикрочипы можно использовать при проведении ОТПЦР и в дальнейшихманипуляциях (лиофилизации реактивов на поверхности).~ 99 ~III.6.
Проведение ОТПЦР на микрочипах с нанесеннымиуглеродсодержащими пленками с использованием микрочипового ПЦРанализатораИзвестно, что при проведении ОТПЦР в микрореакторах увеличиваетсявероятность ингибирования реакции из-за необратимой сорбции компонентовПЦР смеси и деактивации фермента Taq-полимеразы [154]. В работе [155]показано, что использование необработанного алюминия для проведения ПЦРприводит к ингибированию реакции. Авторыпредложили наносить наповерхность фольги полимерное покрытие толщиной 5 мкм, с гидрофобнымисвойствами, а также использовали бычий сывороточный альбумин в качествединамического пассиватора. Однако применение полимерных покрытий сбольшой толщиной препятствует достижению высоких скоростей нагрева иохлаждения, а применение высоких концентраций БСА может привести кизменению условий протекания ОТПЦР, поэтому создание тонких покрытий,которые препятствуют подобным процессам, представляет большой практическийинтерес.
Биосовместимость полученных покрытий проверяли в условиях ПЦР вмикрочиповом анализаторе «АриаДНА» (Люмэкс, Россия).Влияние поверхности на проведение ОТПЦР можно оценить путемсравнения величин порогового цикла (Ct) для микрочипов с покрытием (образцыА–F ) и для микрочипов, обработанных только в плазме кислорода и аргона.Сравнение проводили как для РНК, так и для ДНК.Выбранный термопротокол анализа пробы 35S позволил оценить не толькоустойчивость полученных покрытий в условиях ПЦР, но и их резистивность крезким перепадам температур в процессе реакции.Следует отметить, что в случае РНК-содержащих проб вероятностьингибирования возрастает [154], а термопротокол в данном случае также занимаетв два раза больше времени.
Исходя из всего выше сказанного, можно было бы~ 100 ~ожидать неудовлетворительных результатов при проведении ОТПЦР для РНКсодержащих проб при достаточно эффективном прохождении классической ПЦР.Пороговые циклы ПЦР и ОТПЦР в зависимости от условий обработкипластин представлены в табл. 10.Таблица 10. Результаты ПЦР-анализа проб РНК на полученных микрочипах суглеродсодержащим покрытиемОбразецt4,W4,минВтCt, номер цикла (n = 10, P = 0.95)35SНБИБК( зонд FAM)( зонд ROX)Ar/O2––25.0 ± 0.218.8 ± 0.120.0 ± 0.2A104023.5 ± 0.417.1 ± 0.321.2 ± 0.2B102025.8 ± 0.616.9 ± 0.117.3 ± 0.1C102025.1 ± 0.117.3 ± 0.616.4 ± 0.1D101025.1 ± 1.118.0 ± 0.518.1 ± 0.1E54030.9 ± 0.116.4 ± 0.317.8 ± 0.3F24024.1 ± 0.1Не старт20.2 ± 0.1При сравнении величины порогового цикла ПЦР Ct для анализа ДНК 35Sвидно, что величина Ct для образцов A и F меньше, чем для алюминиевогомикрочипа без обработки в плазме таким образом, эти образцы можно считатьоптимальными для проведения ПЦР.Тот же набор микрочипов проанализирован в условиях ОТПЦР.
Согласнотабл. 4 отсутствие ингибирования ОТПЦР характерно для образцов B, C, D, E.При этом образцы B и E по результатамОТПЦР-анализа оказалисьнеустойчивыми к перепадам температуры.Таким образом, оптимальным сочетанием характеристик по результатамОТПЦР и ПЦР-анализа обладают образцы С и D. Также, стоит отметить образецВ, обладающий отличными характеристиками, но при этом с большим разбросомвеличины Ct для анализа ДНК.~ 101 ~Следует отметить, что использование повышенной мощности разряда вовторой стадии синтеза ГМДС-покрытий позволило добиться гидрофильныхсвойств поверхности (контактный угол составил примерно 50°), что обеспечилодостаточно эффективное растекание ПЦР-раствора при введении его вмикрореакторы чипа с полученным покрытием.
Гидрофильные свойстваподобного покрытия обеспечили хороший термический контакт раствора споверхностью микрочипа, что определило высокие скорости нагрева иохлаждения, характерные для микрочиповых аналитических систем молекулярногенетического анализа.Таким образом, полученные нами результаты показывают, что из множестваизвестных мономеров, которые используются при плазмохимическом синтезепокрытий, самым перспективным является ГМДС и ацетилен. При этомобразуется плотная однородная углеродсодержащая пленка, которая надежнозащищает поверхность микрочипа от взаимодействия с ПЦР-буфером и неингибируетамплификацию.Такжеисследованиепоказало,чтопленки,полученные из спиртов, деградируют при хранении на воздухе, а пленки,полученные из углеводородов, имеют небольшую адгезию к поверхностиалюминия, что отрицательно влияет на их работоспособность в среде ОТПЦР.~ 102 ~IV.Подбор оптимальных физических условий для иммобилизации ПЦРреагентов на поверхности алюминиевых микрочипов на примере ДНКсистемIV.1.
Оптимизация методики модификации поверхности подложкимикрочипаВ процессе иммобилизации ПЦР-реагентов на поверхности алюминиевыхмикрочиповвопросинертнойповерхностииингибированияферментовстановится еще более актуальным. Так, при обработке поверхности алюминиевыхмикрочипов химическими агентами (щелочи, кислоты, и т.д.) удается получитькривые ПЦР с небольшим разбросом и достаточно низкими значениями фоновойлинии при использовании жидких реактивов. Однако в случае последующейиммобилизации удовлетворительные результаты ПЦР удавалось получить лишь вслучае кремниевых микрочипов, обладающих почти идеальной поверхностью[156]. В случае алюминиевых микрочипов наблюдалась сниженная интенсивностьсигнала, невысокая эффективность реакции и малая продолжительность хранениятаких микрочипов при комнатной температуре.С другой стороны, подход плазмохимической обработки является менеедеструктивным для морфологии поверхности микрочипа.
К тому же, послеобработки в плазме, поверхность микрочипов становится гидрофильной. Нодостаточно ли степени такой гидрофильности для дальнейших манипуляций смикрочипом?Установлено, что подложки, обработанные в плазме, в течение пяти днейтеряли гидрофильные свойства, при этом иногда наблюдалось уменьшениеинтенсивности аналитического сигнала, а иногда и полная потеря реакционнойспособности. В то же время чипы, поверхность которых дополнительно~ 103 ~обработана специальным пассивирующим раствором, давали удовлетворительныерезультаты (рис. 44).Рис.
44. ПЦР-анализ ДНК-образцов в зависимости от влияния поверхности: а), б) – потеряинтенсивности аналитического сигнала; в) – отсутствие влияния поверхности после обработкиповерхности.Таким образом, для проведения ПЦР с использованием жидких реактивов,поверхность микрочипов требовалось обрабатывать пассивирующим раствором.Однако, в состав раствора ПЦР-реагентов, предназначенный для иммобилизациина поверхности микрореакторов уже входили сходные компоненты.
В связи сэтим представляло интерес определить, придают ли иммобилизованные реактивыповерхности микрореактора нужные гидрофильные свойства на достаточнодлительное время, и, следовательно, можно ли исключить этап гидрофилизацииповерхности с помощью пассивирующего раствора.~ 104 ~Для сравнения двух подходов в гидрофилизации поверхности подготовилидве серии микрочипов с иммобилизованной тест-системой для выявления глобинав геноме человека (данная тест-система используется в клинических анализах вкачестве внутреннего контроля выделения пробы из биологических образцов).Одинизмикрочиповподверглипредварительнойгидрофилизации,наповерхности другого иммобилизировали ПЦР-реагенты непосредственно послеплазмохимической обработки.Рис.
45. Усредненные кривые ПЦР, проведенные с использованием иммобилизованныхреактивов на чипах с гидрофилизацией поверхности пассивирующим раствором и без нее.В результате ПЦР-анализа (рис. 45) показано, что исключение стадиигидрофилизации не привело к ухудшению аналитических характеристик ПЦР.Пороговые циклы совпали с точностью до доверительных интервалов (Ct = 26.9 ±0.6 (n = 30, P = 0.95) – без гидрофилизации, Ct = 27.6 ± 0.4 (n = 28, P = 0.95 – сгидрофилизацией).иммобилизацииВдальнейшемреагентов,микрочипы,изготавливалисьбезпредназначенныестадиидлягидрофилизации~ 105 ~поверхности пассивирующим раствором.
Таким образом, удалось сократить числотехнологических операций по подготовке микрочипов.IV.2. Оптимизация условий для экспериментальной установки дляиммобилизации реактивовПри использовании лиофилизации как метода иммобилизации ПЦРреактивов требуется соблюдение определенных условий. В классическомпониманииметодалиофилизациивысушиваемыйпрепаратнеобходимопредварительно заморозить, а затем сублимировать растворитель внутривакуумной камеры. При этом важно сохранять препарат в замороженномсостоянии, чтобы избежать кипения раствора.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
