Диссертация (1150270), страница 19
Текст из файла (страница 19)
Таким образом, исходя иззначений погрешности (для разбавленного стабилизатора №3 погрешностьминимальная),атакжесцельюсокращениярасходареактивов,дляиммобилизации реактивов выбран раствор стабилизаторов № 3.По данным, приведенным в табл. 18 построена полиномиальная линия трендасо степенью полинома, равной 3, которая позволила вычислить коэффициентсоответствияразноститемпературхранениямикрочипов.Изграфиказависимости, приведенного на рис. 66 определен коэффициент соответствия К,равный 17.2 при разнице температур в 31 °С.Рис.
66. График зависимости коэффициента соответствия К от разницы температурускоренного и стандартного хранения.Таким образом, в соответствии с формулой, срок хранения микрочипов симмобилизированными реактивами при +4 °С составила 103 дня.Для того, чтобы оценить сроки хранения микрочипов, исходя из принятогограничного значения порогового цикла (Сt = 40), была проведена экстраполяцияполученных кривых для смеси стабилизаторов № 3 (с учетом коэффициента K).Из рис.
65 б следует, что используя 2 мг/мл добавку БСА, разработанныемикрочипы можно использовать в качественном анализе, а также скрининге втечение восьми месяцев. Такие сроки ранения полностью покрывают нужды~ 132 ~лаборатории и являются достаточными для внедрения микрочиповой системы ваналитическую практику.V.5. Исследование стабилизации положительного РНК контроля в процессеискусственного старенияВметодеОТПЦРположительныйконтрольприменяется,чтобыудостовериться в том, что реактивы работают с необходимой для проведенияанализа эффективностью.
Так, в случае, если положительный контроль не даложидаемогорезультата,неприемлемыми,арезультатывсехотрицательныепробпробывэтойсчитаютсериисчитаютпотенциальноложноотрицательными. Иммобилизация положительного контроля позволила быминимизироватьручнуюработуисследователя,атакжеспособствоватьодинаковым условиям хранения реагентов, поэтому следующим этапом созданиякомплексной иммобилизированной тест-системы стало проведение испытаний полиофилизации положительного контроля. В случае вирусов птиц, в качествеположительной пробы взяли вакцину ИБК штамм H120, которая представлялаослабленный вирус инфекционного бронхита, а также искусственную плазмидувируса в разных концентрациях.
При этом эффективное протекание реакции симмобилизированнымиреагентамисдобавлениемвакциныдолжносвидетельствовать о сохранении ферментативной активности и ревертазы иполимеразы. Для отдельной проверки стабильности полимеразы оценивалипротекание реакции с иммобилизованной плазмидой, так как она представлялаименно кДНК-участки и, в таком случае стадия транскрипции не нужна.Положительный контроль иммобилизировали с выбранным ранее растворомстабилизаторов № 3 с добавкой БСА (2мг/мл).
Для определения срока годностимикрочипов с иммоблизированными положительными контролями, температураэкспериментального хранения tэ, также составила +35 °С, экспериментальныйсрок годности при 35 °С составил 6 суток. Для проверки эффективности~ 133 ~стабилизирующего действия по истечении определенных интервалов времени, двамикрочипа партии, снимали с термостата для проведения ОТПЦР. Учитывая, чтореакционная смесь уже включала в себя все необходимые компоненты, в томчисле исходную матрицу ДНК в случае с плазмидой или РНК в случае свакциной, в ячейки микрочипа добавляли только воду и ПЦР-буфер. Полученныеданные приведены в табл.
19. К сожалению, исходная концентрация вакцины неуказывается в паспорте из соображений коммерции, поэтому в таблице указаныкратности разбавления исходного раствора.Эффективность ПЦР была оценена по углу наклона градуировочнойзависимости, исходя из формулы:E=А,где A – угловой коэффициент градуировочной зависимости порогового цикла отконцентрации ДНК (а случае плазмиды) или кДНК (в случае вакцины). ЗначенияE находились в пределах от 95 до 100% на протяжении всего эксперимента посостариванию микрочипа с лиофилизированными реактивами, что указывает наотсутствие значительной потери активности ферментов, а также подтверждаетинертность поверхности алюминиевого микрочипа. Графики зависимостейпорогового цикла ОТПЦР от длительности старения для микрочипов симмобилизированными положительными контролями представлены на рис.
67~ 134 ~Таблица 19. Значения пороговых циклов ОТПЦР для полностью иммобилизированныхРНК тест-системПороговый циклПлазмидавакцинаДлительность12012Е, %старения, днипкг/мклпкг/мклn=3013.9217.04114.072cо×10–3cо×10–4102 ± 325.1328.3717.21102 ± 125.9131.2514.3917.5198 ± 227.5231.99314.6517.8698 ± 329.0233.75414.9718.1297 ± 231.8235.57515.3118.4398 ± 233.1236.14615.6218.9295 ± 234.8137.82.Рис. 67. Графики зависимостей порогового цикла от длительности старения для микрочипов симмобилизированными положительными контролями с использованием растворастабилизаторов № 3 и раствора БСА 2 мг/мл.
1 – раствор вакцины 1:1000 , 2 – раствор вакцины1:10000 , 3 – раствор плазмиды 12 пкг/мкл, 4 – раствор плазмиды 120 пкг/мкл.Как видно из представленных выше данных, раствор стабилизаторов № 3 сдобавкой БСА позволяет эффективно стабилизировать не только реактивы, но и~ 135 ~положительные контроли – вакцину вируса и кДНК плазмиду. Однако, стоитотметит, что в процессе ускоренного старения пороговые циклы в случаеплазмиды несколько возрастают. При лиофилизации вакцины, напротив,наблюдается более крутая зависимость порогового цикла от продолжительностихранения.
Пороговые циклы для двух представленных концентраций отличаются,в среднем, на 3.5 цикла. В соответствии с формулой для пересчета сроковискусственного старения в срок хранения следует, что 6 дней хранениямикрочипов с лиофилизированными реактивами при + 35 °С соответствуют 103суткам хранения при + 4 °С. Таким образом, при таком сроке хранения, растворвакцины, разбавленный в 104 раз относительно исходного раствора можетиспользоваться в качестве внутреннего контроля. При более продолжительномпериоде хранения, вероятно, требуется большая концентрация для обеспечениядостоверных результатов.Таким образом, в результате исследований по стабилизации ПЦР системы,состоящей из двух ферментов, выявлено, что наилучшими показателями из всехисследованных модельных растворов обладает раствор, содержащий трегалозу,ПВП, Tween 20 в концентрациях 13.8, 1.9, 1.1 ммоль/л с добавкой БСА 2 мг/мл.Срок хранения алюминиевых микрочипов с иммобилизированными реактивами,полученный в ходе эксперимента с искусственным хранением составил 103 дняпри + 4 °С, что вполне приемлемо для большинства лабораторных нужд.Успешная лиофилизация положительного и отрицательного контроля позволиладобитьсябольшейдостоверностирезультатованализа,минимизироватьколичество мануальных операций исследователя и создать одинаковые условияхранения всех реагентов ОТПЦР.Оценка специфичности предлагаемой аналитической системы.
В методеОТПЦР для характеристики разработанной тест-системы используют понятиеспецифичности отжига разработанных праймеров по сравнению с другими РНКобъектами, которые могут встретиться в анализируемых образцах. Для проверкиспецифичности предлагаемой аналитической системы было исследовано влияние:~ 136 ~РНК кур, Бурсального вируса (ИБДВ), а также Реовируса (АОРВ). В случаенедостаточной специфичности отжига праймеров наличие данных объектов впробе может способствовать ложноположительным результатам.
Вирусы НБ иИБК также были проверены на предмет кросс-отжига соответствующих тестсистем.Диагностическую специфичность определяли как отношение истинноотрицательных результатов к сумме отрицательных и ложноположительныхрезультатов.Полученные данные (табл. 20) свидетельствуют об отсутствии кросс-отжигамежду разработанными тест-системами, а также о 100% специфичностипредлагаемой аналитической системы относительно РНК-содержащих объектов,которые могут содержаться в исследуемой пробе.Таблица 20.
Данные проверки специфичности предлагаемой аналитической системы вслучае других вирусных агентов а также собственной РНК курИсследуемыйРНК/введенный РНКn О проб(ОТПЦР)n ИО проб(культурально)n ЛП проб(ОТПЦР)Диагностическаяспецифичность,%НБ/ИБК25250100%ИБК/НБ25250100%(НБ/ИБК)/РНК кур25250100%(НБ/ИБК) /АОРВ25250100%(НБ/ИБК)/ИБДВ25250100%~ 137 ~VI.Оптимизация пробоподготовки вирусных пассажей на куриномэмбрионеСтадия пробоподготовки исследуемых образцов часто является ключевой дляуспешногопроведенияОТПЦР.Ввидунаправленностиданногометодааналитической химии именно на скрининг, важным критерием пробоподготовкиявляется ее экспрессность и масштабируемость в условиях потокового анализа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
