Диссертация (1150270), страница 20
Текст из файла (страница 20)
Вначале данной работы опробованы готовые наборы реагентов. Так, системапробоподготовки на основе эффекта преципитации Рибо-ПРЕП показывалаотличные результаты. Выделенная таким образом проба была свободна отингибиторов, долго хранилась и не деградировала в процессе хранения. Однакоданная методика требовала навыков и была достаточно времязатратной.
Другойкоммерческий набор Рибо-СОРБ основан на сорбции НК на поверхностисиликагеля. Данная методика достаточно простая в исполнении, однако чистотаполученной пробы оказалась менее подходящей, чем в предыдущем случае. Ихотя оба коммерческих набора давали вполне приемлемые результаты выделенияРНК, они обладали одним чрезвычайно важным и весомым недостатком. В обоихслучаях в процессе пробоподготовки для осаждения преципитата или очисткисорбента требовалось центрифугирование на скорости 13000 об/мин. Для того,чтоб обеспечить такие условия осаждения требовалась ультрамикроцентрифуга,которая имеет высокую цену а также делает практическим невозможнымпроведение пробоподготовки в полевых условиях и в небольших лабораториях наптицефабриках.С другой стороны, метод адсорбции НК на магнитных частицах не требуетиспользования ультрамикроцентрифуги и позволяет провести пробоподготовкугораздо быстрее.
С целью доказать эффективность подхода с использованиеммагнитного сорбента для РНК использована методика, разработанная в нашейлаборатории для выделения ДНК. Однако, полученные результаты (табл. 21)~ 138 ~выделения РНК из четвертого пассажа вирусов НБ и ИБК свидетельствовали онеэффективности существующей методики в случае вирусов птиц. Вследствиеэтого приняли решение попробовать максимально оптимизировать стадиипробоподготовки на основе суспензии магнитного сорбента и приблизить их ккоммерчески доступным по пороговым циклам ОТПЦР.Таблица 21. Результаты выделения вирусов НБ и ИБК референтными методами РИБО-ПРЕП(1), РИБО-СОРБ (2) и магнитными частицами (3) и спектрофотометрическая чистота ихвыделенных проб (n = 7, P = 0.95)НБCtА260/А280РИБО-ПРЕПРИБО-СОРБМЧ13.4 ± 0.71 (5.3%)14.27 ± 0.14 (1.0%)29.69 ± 0.46 (1.5%)2.11.751.24РИБО-ПРЕПРИБО-СОРБМЧ18.98 ± 0.58 (3.1%)18.73 ± 0.48 (2.6%)31.5 ± 1.77 (5.6%)1.981.831.53ИБКCtА260/А280VI.1.
Оптимизация температуры и времени лизиса клеток для схемыпробоподготовки на основе суспензии магнитного сорбентаНа первой стадии пробоподготовки РНК для дальнейшего ОТПЦР анализаисследуемее клетки разрушали с помощью хаотропных веществ, которыевзаимодействовали непосредственно с клеточными мембранами. В данной работеиспользовали лизирующий раствор на основе солей гуанидина. Стоит отметить,разрушение клеток и их органелл обязательно проводится при высокихтемпературах, однако слишком сильное нагревание может способствоватьдеградации РНК, поэтому, практический интерес представляло найти такую~ 139 ~температуру стадии лизиса, при которой разрушение было бы эффективным, и вто же время безопасным для фрагментов РНК.Пробы пассажей вирусов НБ и ИБК подвергали лизису в течение разноговремени, остальные стадии пробоподготовки проводили одинаково.
Полученныерезультаты приведены на рис.68 и 69.4540Ct3513052520342246810t, minРис. 68. График зависимости порогового цикла от времени лизиса клеток, зараженных вирусомNVD при разных температурах: 1 — 60 °С, 2 — 70 °С; 3 — 80 °С; 4 — 85 °С; 5 — 90 °С.3634322Ct30132852642422246810t, minРис. 69 График зависимости порогового цикла от времени лизиса клеток, зараженных вирусомИБК при разных температурах: 1 — 60 °С, 2 — 70 °С; 3 — 80 °С; 4 — 85 °С; 5 — 90 °С.~ 140 ~Как видно из представленных графиков, характер зависимости пороговыхциклов от времени лизиса сходный для обоих вирусов. Так, при 60 °С даже 10минут нагрева недостаточно для полноценного разрушения клеток – пороговыециклы достаточно высокие. Стоит также отметить очень высокое значениепогрешности значения порогового цикла при этой температуре, что такжесвидетельствует о низкой воспроизводимости процесса лизиса.
Аналогичнаяситуация наблюдается и при высокой температуре (90 °С). Причиной высокихпороговых циклов при 90 °С может быть и высокая вероятность частичнойденатурации молекул РНК, однако при увеличении времени нагревания сильногоповышения порогового цикла не наблюдается, относительная погрешностьневысокая.В случае вируса Ньюкасла максимальной концентрации РНК удалосьдостичь при нагревании пробы с лизирующим раствором при 70 °С в течение 5минут. Близкие результаты также показала обработка пробы при 80 °С.
Данные,полученные с помощью нагревания при таких температурах отличались такженебольшой погрешностью и хорошей воспроизводимостью.В процессе лизиса клеток, зараженных вирусом бронхита, максимальнойэффективности и минимальной погрешности удалось добиться при нагреваниилизата в течение 8 минут при 80 °С, а также при 85 °С.Для того, чтобы определиться с оптимальной температурой лизиса, котораяподходила бы для обоих вирусов, стоит также удостовериться в чистоте пробы,так как этот параметр является критическим для проведения ОТПЦР.
Для оценкичистоты пробы используют параметр А260/А280, который является отношениемпоглощения пробы при двух длинах волн. Считается, что проба является чистой ипригодной для дальнейшего проведения ПЦР, если А260/А280 приближается кзначению 2. Спектрофотометрические исследования проб вирусов представленына рис.70 и 71~ 141 ~3,23,02,832,6A260/A2802,42,22,0211,81,641,41,251,0246810t, minРис. 70. График зависимости чистоты выделенных проб вируса НБ (А260/А280) от времени итемпературе лизиса НБ при: 1 – 60 °С, 2 – 70 °С; 3 – 80 °С; 4 – 85 °С; 5 – 90 °С.3,02,952,82,742,6A260/A2802,512,42,32,22,122,01,91,831,71,6246810t, minРис.
71. График зависимости чистоты выделения пробы (А260/А280) от времени и температурелизиса ИБК при: 1 – 60 °С, 2 – 70 °С; 3 – 80 °С; 4 – 85 °С; 5 – 90 °С.Из графиков видно, что чистота выделенной РНК достаточно сильно зависитот температуры лизиса. Так, в случае лизиса обоих вирусов при 70 °С отношениеА260/А280 принимает значения, которые максимально близки к двум. В качествеоптимального времени обработки выбрали 8 минут.Такимобразом,оптимальныетемператураивремялизисадляпробоподготовки РНК оказались ниже, чем для ДНК ввиду того, что молекулыРНК подвержены деградации в большей степени.~ 142 ~VI.2.
Оптимизация стадии сорбции РНК на поверхности магнитногосорбентаПрименение магнитных сорбентов на основе оксида кремния хорошоизучено в случае ДНК. Учитывая неселективные механизмы сорбции НК наповерхности таких сорбентов можно предположить, что они будут неплохоадсорбировать молекулы РНК. Однако, ввиду неселективного связывания сгидроксильными группами на поверхности следует также ожидать и сорбциинекоторых ингибиторов, таких как белки, сложные полисахариды, производныежиров.
Ввиду этого, следует изучить зависимость сорбции искомых фрагментовРНК от количества введенной в лизат суспензии сорбента.Так, к разным объемам суспензии магнитного сорбента были добавленылизаты вирусов Ньюкасла и куриного бронхита, подготовленные в одинаковыхусловиях (рис. 72).26,526,0225,525,0Ct24,524,0123,523,022,522,0246810V, mklРис. 72. График зависимости порогового цикла ОТПЦР от объёма суспензии магнитногосорбента на основе оксида кремния для выделенных проб 1 — вируса НБ и 2 — вируса ИБК.Как видно из графика, при увелечении объема суспензии магнитногосорбента с 2 до 7–8 мкл наблюдается снижение порогового цикла ОТПЦР, то естьувелечение концентрации выделенной РНК. Однако, при дальнейшем росте~ 143 ~конечной концентрации сорбента значение пороговых циклов растет, что можетбыть связано как раз с сорбцией побочных продуктов лизиса клеток.Таким образом, оптимальное количество суспензии магнитного сорбентаследует принять за 7–8 мкл.VI.3.
Очистка сорбента от гидрофильных и гидрофобных ингибиторовПосле того, как молекулы РНК адсорбировались на поверхности магнитногосорбента,следуетстадияочистки.Какужеотмечалосьвыше,ввидунеселективной сорбции на поверхности сорбента могут находится всевозможныегидрофильные и гидрофобные примеси, которые впоследствии способныингибировать ОТПЦР. В класическом подходе для ДНК используют две стадииочистки. Для гидрофильных ингибиторов, таких, как белки, используют 70%этиловый спирт; а от гидрофобных примесей (жиры и их производные) сорбентможно очистить с помощью ацетона.В случае РНК было принято в качестве очищающих растворов взять те жерастворители.
Однако, ввиду невысокой температуры лизиса, на поверхностьсорбента могли сорбироваться большие фрагменты молекул, которые могут и неочиститься, поэтому стоило попробовать очищать сорбент одним и тем жерастворителем несколько раз. Отметим, что после каждой очистки пробиркитщательно ресуспендировали, а потом вставляли в магнитный штатив, избегаястадии центрифугирования на ультрацентрифуге.Результаты ОТПЦР в зависимости от способа очистки РНК спиртом иацетоном представлены в рис. 73 и 74.~ 144 ~2Alcoholwash31ne21wash3AcetoCt25,024,824,624,424,224,023,823,623,423,223,022,822,622,422,222,021,821,6Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
