Диссертация (1150270), страница 21
Текст из файла (страница 21)
73. Диаграмма зависимости порогового цикла ПЦР от количества раз обработки сорбента вспирте и ацетоне для вируса Ньюкасла.26,025,525,024,524,023,523,0Ct22,522,021,032Alcohol wash31neeto21Ac20,0wa20,5sh21,5Рис. 74. Диаграмма зависимости порогового цикла ПЦР от количества раз обработки сорбента вспирте и ацетоне для вируса инфекционного бронхита.~ 145 ~Характер зависимости порогового цикла от степени очистки сходен в случаеобоих вирусов. Так, увеличение количества раз очистки с помощью спирта (3раза) ведет к сильному повышению пороговых циклов ОТПЦР, что соответствуетнизким концентрациям РНК. Вероятно, в процессе многократной обработкиспиртом происходит частичное смывание молекул РНК с сорбента.
Однако видно,что одного раза обработки недостаточно. Таким образом, оптимальной очистки отгидрофильных примесей можно добиться, применяя спирт два раза.Обработка ацетоном влияет на концентрацию не так критично. Из диаграмм73 и 74видно, что 2–3 раза очистки сорбента в ацетона дают схожие результаты вслучае двух вирусов.В табл. 22 и 23 представлены спектрофотометрические данные о чистотепроб, полученных в результате разных стадий очистки сорбента.Таблица 22. Спектрофотометрческая чистота (А260/А280) проб вирусаНьюкасла в зависимости от количества стадий очисткиСпирт1 раз 2 раза 3 разаАцетон1 раз1.341.301.332 раза1.251.101.573 раза1.271.261.26Таблица 23.
Спектрофотометрческая чистота (А260/А280) проб вирусакуриного бронхита в зависимости от количества стадий очисткиСпирт1 раз 2 раза 3 разаАцетон1 раз1.341.321.362 раза1.251.391.183 раза1.471.281.40~ 146 ~В случае вируса Нюкасла максимальной чистоты пробы удалось добитьсяпри очистке пробы 2 раза спиртом и 3 раза ацетоном. И хотя для вируса бронхитамакимальная чистоту пробы показала обработка 1 раз спиртом и 3 раза ацетоном,но в связи с данным ОТПЦР обработка по схеме 2 раза спиртом и два разаацетоном также показала приемлимые результаты.Таким образом, при очистке сорбента 2 раза спиртом и два раза ацетономудалось получить достаточно чистые пробы для дальнейшего анализа.VI.4. Оптимизация стадии элюирования РНК с магнитного сорбентаНазаключительномэтапепробоподготовкиадсорбированныенаповерхности магнитного сорбента РНК элюировали РНК-буфером.
Для смещенияравновесия в процессе десорбции нужно нагревать систему, однако следуетизбегать слишком высоких температур ввиду термической деградации РНК.На рис. 75 и 76 представлены результаты элюирования РНК при разныхтемпературах и временах удерживания.27,527,0226,526,03Ct25,525,024,5124,0423,523,022,55101520t, minРис. 75. График зависимости порогового цикла ОТПЦР от температуры и времени элюированияРНК с магнитного сорбента для вируса НБ: 1 — 60 °С, 2 — 70 °С; 3 — 80 °С; 4 — 85 °С; 5 — 90°С.~ 147 ~29,028,5128,027,527,026,526,0Ct25,5425,024,5324,023,5223,022,522,021,546810121416182022t, minРис.
76. График зависимости порогового цикла ОТПЦР от температуры и времени элюированияРНК с магнитного сорбента для вируса ИБК: 1 — 60 °С, 2 — 70 °С; 3 — 80 °С; 4 — 85 °С; 5 —90 °С.Из представелнных графиков видно, что 60 °С недостаточно для того, чтобывсе молекулы РНК десорбировались с магнитного сорбента, так как полученныезначения пороговых циклов высокие.
С другой стороны, при слишком высокойтемпературевозможначастичнаядеградациямолекулРНК,чтотакжесопровождается высокими Ct.Исходя из графиков для обоих вирусов принято, что оптимальное времядесорбции составляет 15 минут при 80 °С, так как в таких условиях для обоихвирусов удалось получить приемлемые результаты.Отдельно стоит рассмотреть вопрос, каким объемом РНК-буфера следуетпользоваться для десорбции РНК с поверхности магнитного сорбента.
С однойстороны проба должна быть достаточно концентрированной для дальнейшегопроведения ОТПЦР, однако при высоких концентрациях РНК следует такжеожидать и высоких концентраций ингибиторов, которые в то или иной степенивсе равно присутствуют в элюате. На рис. 77 представлен график зависимостипорогового цикла от объёма элюирующего РНК-буфера в случае двух вирусов.Ct~ 148 ~30,029,529,028,528,027,527,026,526,025,525,024,524,023,523,022,522,021,521,0212030405060708090100110V, mklРис. 77. График зависимости порогового цикла от объёма элюирующего раствора для 1 –вируса НБ и 2 – вируса ИБК.Из рисунка 77 следует, что при десорбции 50 мкл буфера пороговые циклыОТПЦР ниже, чем при 25 мкл. Можно предположить, что двукратное разбавлениеведет к нивелированию ингибиторного эффекта некоторых примесей, которыедесорбировались помимо целевых РНК.
При дальнейшем увеличении объемаэлюентанаблюдаетсяростпороговыхциклов,который,по-видимому,соответствует разбавлению пробы.Для оценки полноту десорбции РНК в предложенных условиях, стадиюэлюирования проводили последовательно несколько раз. Результаты ОТПЦРданного эксперимента представлены в табл. 24.Таблица 24. Результаты последовательного элюирования с магнитногосорбента для НБ и ИБК (n = 10, P = 0.95)пробаCtПробаCtНБ (первый раз)21.34 ± 0.36ИБК (первый раз)21.19 ± 0.22НБ (второй раз)23.15 ± 0.04ИБК (второй раз)25.72± 0.23НБ (третий раз)нет стартаИБК (третий раз)27.00 ± 0.29Как видно из таблицы, пороговые циклы ОТПЦР, полученные при повторномэлюировании с сорбента отличаются на 3–4 единицы.
Исходя из этого, можно~ 149 ~сделать вывод, что более 90% связанной РНК десорбировали с сорбента с первогораза.В табл. 25 представлены результаты сравнения предлагаемых условийпробоподготовки с аналогичными условиями для ДНК, которые пробовалииспользовать для РНК без оптимизации. Так, данные ПЦР указывают, что спомощью подбора правильных параметров удалось увеличитьконцентрациюРНК в пробе на три порядка.Таблица 25. Результаты выделения НБ и ИБК с помощью магнитного сорбента до и послеоптимизации (n = 10, P = 0.95)пробаСtчистота выделения(А260/А280)НБ до оптимизацииНБ послеоптимизацииИБК дооптимизацииИБК послеоптимизации29.69 ± 0.461.2421.25 ± 0.111.4431.5 ± 1.771.5321.62 ± 0.411.58После оптимизации всех стадий пробоподготовки проведено сравнение повременным затратам а также количеству ручных операций между предложеннойметодикой и коммерчески доступными наборами.
Для того, чтобы провестипробоподготовку стандартными методами, требовалось 40–45 минут а также 52(РИБО-ПРЕП) и 62 (РИБО-СОРБ) ручных операции. В то же время для методикина основе магнитного сорбента нужно всего 25 минут и 24 ручных операции.Таким образом, трудовые затраты сократились почти в два раза. Такженеобходимозаметить,чтоприменениемагнитногосорбентапозволилозначительно сократить энергетические затраты ввиду отсутствия необходимостииспользоватьмощнуюидорогостоящуюультрацентрифугу.Безусловно,используя магнитный сорбент, не удалось достичь таких же пороговых цикловОТПЦР, как для коммерческих методов, однако полученная таким образом~ 150 ~концентрация РНК легко обеспечивает качественное определение искомыхвирусов.Оценка чувствительности микрочиповой аналитической системы.
Для того,чтобы оценить чувствительность предложенной аналитической системы слиофилизированными реактивами, включая стадию пробоподготовки, былосделано предположение о начальной концентрации используемой вакцины ИБК,штамм Н120. В существующих данных встречаются оценки концентрациикоммерчески доступных вакцин на уровне 100 нг/мл. Учитывая длину геномаисследуемыхвирусов(27000парнуклеотидов)такиеконцентрациисоответствуют 7 × 109 копий/мкл. Таким образом, градуировочная зависимостьпорогового цикла от логарифма концентрации РНК примет следующий вид (рис.78)Рис. 78.
Градуировочная зависимость для определения вируса ИБК штамм Н120 с помощьюмикрочиповой аналитической системы с лиофилизированными реактивами.Как было отмечено ранее, в методе ОТПЦР старт кривых после 40 цикла,связанный со специфическим отжигом праймеров на искомых РНК ненаблюдается. Исходя из этого факта, можно провести оценку чувствительностипредлагаемой системы. Так, старт на 40 цикле соответствует порядку 100~ 151 ~копий/мкл. Такая чувствительность встречается и для стандартной пробирочнойОТПЦР при анализе вирусов. В случае иммунохимических методов (например,блоттинга) а также культурального метода пассажей чувствительность методикдля определения вирусов НБ и ИБК ниже.Таким образом, разработанная микрочиповая аналитическая система можетиспользоваться для скрининга большого количества проб, а также длякачественного определения вирусов НБ и ИБК.
При этом, в сравнении склассическими методами время анализа сокращается в десятки раз, апредложеннаянепосредственносхемавпробоподготовкинебольшихпозволяетветеринарныхтранспортировки термолабильной РНК.проводитьанализлабораториях,избегая~ 152 ~ВЫВОДЫ1.Разработана аналитическая система с микрочипами из алюминия,поверхность которых модифицирована методом плазмохимического осаждения,содержащими полностью лиофилизированные реактивы для определения РНКметодом ОТПЦР.2.Эффективность ПЦР с лиофилизированными ОТПЦР реактивамиувеличена до предельно возможной величины 98 2% за счет модификацииповерхности алюминиевых микрочипов с помощью метода плазмохимическогосинтеза углеродсодержащих пленок, что позволило существенно увеличитьпроизводительность и технологичность процесса производства микрочипов.3.Разработан способ и создана экспериментальная установка длялиофилизации ОТПЦР реактивов в алюминиевых микрочипах.4.Достигнуты достаточно длительные для практического применениясроки хранения микрочипов с полностью лиофилизированными реактивами иконтрольными образцами (8 месяцев), что позволило их использоватьприпроведении анализа реальных образцов.5.Разработана методика пробоподготовки биологического материала,содержащего вирусы, с использованием магнитного сорбента для определенияРНК с помощью микрочиповой ОТПЦР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
