Автореферат (1150269)
Текст из файла
__________САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ__________На правах рукописиСувороваАлександра ОлеговнаМИКРОЧИПОВАЯ АНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯРИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХРЕАКТИВОВ МЕТОДОМ ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙСпециальность 02.00.02 – аналитическая химияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукСанкт-Петербург2016~2~Работа выполнена на кафедре аналитической химии Института химии Санкт-ПетербургскогоГосударственного Университета.Научный руководитель:Ганеев Александр Ахатовичдоктор физико-математических наук, профессор,Санкт-Петербургский государственныйуниверситетОфициальные оппоненты:Проскурнин Михаил АлексеевичДоктор химических наук, профессорФГОУВО «Московский государственныйуниверситет имени М.В.Ломоносова»Богданов Константин ВикторовичКандидат биологических наукВедущий научный сотрудник НИИ ГематологииФГБУ «Северо-Западный Федеральныймедицинский исследовательский центр имениВ.А.
Алмазова»Ведущая организация:ФГБНУ «Всероссийский научноисследовательский ветеринарный институтптицеводства»Защита диссертации состоится «____» марта 2016 г.Вчас. мин. на заседании диссертационного совета Д-212.232.37 по защите диссертациина соискание ученой степени кандидата химических наук при Санкт-Петербургскомгосударственном университете по адресу: 199004, Санкт-Петербург, Средний проспект В.О., д.41/43, БХА.С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им.
А.М. Горького по адресу:199134, Санкт-Петербург, Университетская наб., д. 7/9, а также на сайте www.spbu.ruАвтореферат разослан « ____» февраля 2016 г.Ученый секретарь диссертационногосовета, к. ф.-м. н.Панчук В.В.~3~ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫАктуальность работыМолекулярно-генетические методы являются одним из важнейших направлений в современнойаналитическойхимии.Дляопределениянуклеиновыхкислотнаиболееширокоераспространение получил метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который обладаетуникальными аналитическими характеристиками, такими как: высокая чувствительность,экспрессность и высокая специфичность к нуклеиновым кислотам.
В качестве варианта этогометода для анализа объектов, содержащих вирусы на основе рибонуклеиновых кислот (РНК),применяется метод ПЦР с дополнительной стадией обратной транскрипции (ОТПЦР). Даннаястадия позволяет превратить искомую РНК в комплементарную ДНК (кДНК), пригодную длядальнейшего определения по классической схеме ПЦР.В последние годы широкое распространение для осуществления ПЦР нашли микрочиповыетехнологии. Но до сих пор предложено очень небольшое количество микрочиповыханалитических приложений, в которых реализован метод ОТПЦР. Более того, ввидунестабильности двухферментной системы ПЦР-реактивов, содержащей ревертазу и полимеразувместе,вмикрочиповыхсистемахспособлиофилизацииОТПЦР-реактивоввнутримикрореакторов практически не применяется.
При этом, многократное пипетирование ОТПЦРреактивов значительно увеличивает трудозатраты метода и сокращает возможности примененияОТПЦР в полевых условиях. Таким образом, ввиду большого количества вирусныхвозбудителей, существует потребность в разработке новых микрочиповых систем слиофилизированными ОТПЦР-реактивами для применения в таких областях как ветеринарныйконтроль, рыбоводство, птицеводство.Целью настоящей работы явилась разработка микрочиповой аналитической системы симмобилизированнымиреактивамивмикрореакторахалюминиевогомикрочипадляопределения РНК методом ОТПЦР на примере обнаружения вирусов птиц и ее практическаяапробация на реальных объектах.Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи: Найти условия модификации свойств поверхности алюминиевых микрочипов спомощью метода плазмохимического осаждения (ПХО) углеродсодержащих пленок дляобеспечения эффективной лиофилизации реактивов. Провести исследования свойств полученных покрытий: инертности и устойчивости вусловиях проведения ОТПЦР. Разработать экспериментальную установку для лиофилизации реактивов и обеспечитьоптимальные параметры процесса на примере тест-систем для определения ДНК. Обосновать выбор стабилизаторов для одновременной лиофилизации ревертазы и~4~полимеразы в микрореакторах алюминиевых микрочипов, и оптимизировать ихконцентрациидляобеспечениядлительныхсроковхранениямикрочиповслиофилизированными реактивами. Оптимизироватьметодикупробоподготовкивируссодержащихбиологическихматериалов для обеспечения мобильности и экспрессности предлагаемой аналитическойсистемы.Научная новизна.1.
Предложен способ модификации поверхности алюминиевых микрочипов с помощьюплазменногоосажденияполимеровизгазовойфазы,обеспечивающийвозможностьиммобилизации реактивов, необходимых для определения РНК-вирусов методом ОТПЦР.2. Достигнуты высокие значения эффективности ОТПЦР (до 98%) с иммобилизированнымиреактивами в микрореакторах алюминиевого микрочипа, модифицированного предложеннымспособом, на примере обнаружения вирусов птиц.3. Разработан способ лиофилизации всех компонентов ОТПЦР, включая полимеразу и ревертазу,а также плазмиды и вакцины вирусов в микрореакторах модифицированных алюминиевыхмикрочипов с помощью добавки бычьего сывороточного альбумина (БСА) в смесьстабилизатороввкачествединамическогопассиватора,чтопозволилообеспечитьдолговременную стабильность микрочипов при хранении в течение 8 месяцев.Практическая значимость работы.1.
Разработан макет микрочипа с иммобилизированными реактивами для определения РНКметодом ОТ ПЦР в режиме реального времени (ОТПЦР РВ) на примере обнаружениявирусов птиц.2. Разработана принципиальная схема методики пробоподготовки на основе магнитногосорбента для определения РНК с помощью микрочиповой ОТПЦР, позволяющая проводитьанализ в полевых условиях.3. На примере обнаружения вирусов птиц в реальных образцах показано, что разработанныймикрочип позволяет значительно сократить затраты на дорогостоящие реактивы, упроститьработу оператора и снизить вероятность кросс-контаминации образцов.Публикации.
По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисов докладов.Апробация работы. Результаты работы были представлены в виде докладов на~5~следующих научных мероприятиях: World Congress on Engineering and Technology CET 2012(Пекин, 2012), 1-ой Зимней молодежной школе-конференции с международным участием«Новыеметодыаналитическойхимии»(Санкт-Петербург,2013),VIIВсероссийскойконференции «Менделеев – 2013» (Санкт-Петербург, 2013), VIII Всероссийской конференции«Менделеев – 2014» (Санкт-Петербург, 2014), 97th Canadian Chemistry Conference and Exhibition:"Chemistry from Sea to Sky" (Ванкувер, 2014), III Всероссийской студенческой конференции смеждународным участием, посвященной 140-летию со дня рождения химика-органика Ю.С.Залькинда (Санкт-Петербург, 2015).Положения и результаты, выносимые на защиту:1.
Основные принципы модификации поверхности алюминиевых микрочипов спомощью плазменного осаждения полимеров из газовой фазы, способствующиедальнейшей иммобилизации реактивов, необходимых для определения РНК-вирусовметодом ОТПЦР в микрореакторах.2. УсловиялиофилизациивсехкомпонентовОТПЦРвнутримикрореакторовмодифицированного алюминиевого микрочипа, позволяющие обеспечить высокиезначения эффективности ОТПЦР на примере обнаружения вирусов птиц.3.
Состав стабилизаторов для лиофилизации всех компонентов ОТПЦР, включаяполимеразу и ревертазу, а также плазмиды и вакцины вирусов в микрореакторахмодифицированных алюминиевых микрочипов, с помощью добавки бычьегосывороточного альбумина (БСА).4.
Результаты прямого обнаружения вирусов птиц в реальных образцах с помощьюразработанного микрочипа ипробоподготовкис использованием суспензиимагнитного сорбента.Личный вклад автора. Авторский вклад состоит в выборе стратегии решения основныхзадач и их экспериментальной реализации, в обработке и оформлении полученных результатов,анализе и обобщении полученных данных и формулировании основных выводов.Структура и объем работы.Диссертационная работа объемом 167 страниц машинописного текста состоит из введения,шести глав, содержащих 78 рисунков и 25 таблицы, выводов, перечня используемыхсокращений и списка литературы, включающего 158 наименований.~6~Основное содержание работыВо введении кратко изложены актуальность данного исследования, основные целиработы.Первая глава работы посвящена обзору литературных источников, в которыхпредставлены общие сведения о методе ПЦР РВ, а также особенности использованиямикрочиповых технологий для проведения данной реакции.
Рассмотрены примеры внедрениямикрочипового подхода для варианта ОТПЦР РВ. Также, особое внимание уделено способаммодифицирования поверхности алюминиевых микрочипов и методам исследования полученныхпленок ввиду того, что в условиях ПЦР поверхность алюминия может быть в недостаточноймере инертной и частично взаимодействовать с компонентами ПЦР.
В обзоре литературыприведены основные особенности иммобилизации ферментов на поверхности пробирок имикрофлюидных устройств. Рассмотрены основные теории стабилизации ПЦР-компонентов спомощью сахаридов, поверхностно-активных веществ, а также динамических пассиваторов, кпримеру, БСА. Отдельный раздел первой главы посвящен методам пробоподготовки реальныхобразцов для последующего проведения ОТПЦР, так как данная стадия значительно влияет наконечный результат, а ее оптимизация в случае вирусов птиц способствует более эффективномупроведению анализа.Во второй главе диссертации описываются использованные в работе экспериментальныеметоды модификации поверхности алюминиевых микрочипов, методики иммобилизацииреагентов в микрореакторах, приготовление стабилизирующих растворов, а также методикипробоподготовки реальных образцов вирусов птиц (вирус куриного бронхита ИБК и вирусболезни Ньюкасла НБ).Ввиду сложных технологических особенностей химической модификации поверхностиалюминиевых микрочипов (рис.1), в качестве оптимального метода для синтеза тонкихзащитных покрытий был выбран подход плазмохимического осаждения из газовой фазы (ПХО).Синтез пленок проводили в установкеDiener Pico (Германия) с высокочастотнымгенератором (40 кГц/200 Вт).В качестве мономеров были протестированыразные классы соединений, с целью найтиРис.1.
Вид собранного алюминиевого микрочипа: а –инертныеполимеры.Последовательныемикрочип до раскапывания реактивов, б – микрочип,стадии ПХО с использованием мономеровпомещенный в картридж перед началом ПЦР-гексаметилдисилоксанаанализа.ацетилена приведены в табл.1.(ГМДС)и~7~Таблица 1. Условия плазмохимического синтеза покрытий на поверхности алюминиевыхмикрочипов и использованием ГМДС и ацетиленаНомерстадииВеществоДавление вкамере, ПаВремяобработки,минМощностьгенератора, %ArРасход газа илимономерамл/мин, режимвпрыска жидкогомономера511951002O21019351003ГМДС + Ar1 впрыск в 5 с + 516стадия 1.101.20стадия 2. 102.80Ацетилен + Ar4Образец А4501020Образец B4501015Образец C4441010Образец D433105Образец E436520Образец F421220+ Ar5O25170.141005Полученныеуглеродсодержащиеэлектрохимическойимпеданснойпленкибылиспектроскопииисследованы(ЭИС),сканирующейспомощьюэлектронноймикроскопии (СЭМ), Рамановской спектроскопии.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
