Автореферат (1150269), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Спектры Боде (зависимость модуля импеданса от частоты), полученные для алюминиевых пластин,обработанных методом ПХО.Согласно данным сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), следует, что всепокрытия на основе ацетилена имеют приблизительно одинаковую толщину в пределахпогрешности (табл.3). Так, можно предположить, что процесс синтеза пленки характеризуетсянезависимыми от мощности генератора и времени нанесения параметрами ввиду того, чтопосле достижения определенной толщины начинается абляция покрытия. Однако было найдено,что мощность генератора во второй стадии модификации может влиять на морфологиюполучаемого покрытия.Таблица3.Значениятолщиныпокрытий, полученные путем обработкиСЭМ-изображений (n = 5, P = 0.95)Образецt4, минW4, ВтТолщинапокрытия, нмABCDEF1010101052402020104040267.9 ±12.7318.1 ±40.1299.7 ±27.9320.6 ±24.9312.6 ±37.3304.1 ±29.2Рис.7.
СЭМ-изображениеразветвленнымицепямиалмазоподобных частиц.образцаFсагломератовНа поверхности алюминиевых пластин при значениях мощности их обработки 20 Вт ивыше (образцы А, B, C, F) характерно образование осадка продуктов полимеризации ацетиленав объеме камеры на стадии синтеза углеродсодержащего покрытия (стадия 4). Более того, впроцессе нанесения покрытия в условиях высокой мощности генератора алмазоподобныечастички слипались в объеме камеры, образуя на поверхности разветвленные цепи иагломераты достаточно близких размеров (рис. 7).~ 13 ~В работе приведены результаты проверки биосовместимости полученных покрытий вусловиях ОТПЦР в микрочиповом анализаторе «АриаДНА» на примере анализа реальныхобразцов вирусов птиц, а также контрольных ДНК-образцов.
Пороговые циклы ПЦР и ОТПЦРв зависимости от условий обработки пластин представлены в Таблице 4.При сравнении величины порогового цикла ПЦР Ct для анализа ДНК 35S найдено, чтовеличина Ct для образцов A и F меньше, чем для алюминиевого микрочипа без обработки вплазме. Таким образом, эти образцы можно считать оптимальными для проведения ПЦР.Таблица 4.
Результаты ПЦР-анализа проб РНК и ДНК на полученных микрочипах суглеродсодержащими покрытиямиОбразецt4,W4,минВтCt, номер цикла (n = 10, P = 0.95)35SНБИБК(зонд FAM)(зонд ROX)Ar/O2––25.0 ± 0.218.8 ± 0.120.0 ± 0.2A104023.5 ± 0.417.1 ± 0.321.2 ± 0.2B102025.8 ± 0.616.9 ± 0.117.3 ± 0.1C102025.1 ± 0.117.3 ± 0.616.4 ± 0.1D101025.1 ± 1.118.0 ± 0.518.1 ± 0.1E54030.9 ± 0.116.4 ± 0.317.8 ± 0.3F24024.1 ± 0.1Не старт20.2 ± 0.1Аналогичный набор микрочипов проанализирован в условиях ОТПЦР. Согласно табл.
4минимальные значения пороговых циклов ОТПЦР характерны для образцов B, C, D, E, приэтом образцы B и E по результатам ОТПЦР-анализа оказались неустойчивыми к перепадамтемпературы. Таким образом, оптимальным сочетанием характеристик по результатам ОТПЦР иПЦР-анализа обладают образцы С и D. Также, следовало отметить образец В, обладающийотличными характеристиками, но при этом с большим разбросом величины Ct для анализа ДНК.В главе 4 показаны результаты подбора оптимальных физических условий дляиммобилизации ПЦР реагентов на поверхности алюминиевых микрочипов после плазменнойобработки на примере ДНК-систем. Было установлено, что именно в процессе лиофилизацииудается сохранить активные свойства основных компонентов ПЦР.
Вероятно, это связано с тем,что при глубокой заморозке матрица трегалозного стабилизатора и воды формирует гомогеннуюструктуру. При дальнейшей сублимации растворителя из образовавшегося лиофильного остатка~ 14 ~молекулы ПЦР, компоненты равномерно окружены молекулами стабилизаторов и неподвергаются деградации. На примере модельных ДНК тест-систем в экспериментах повзвешиванию сухого остатка было показано, что 45 мин достаточно для полной лиофилизацииПЦР реактивов в микрореакторах.Инертностьподготовленнойповерхностиалюминиевогомикрочипавслучаеиммобилизированных реактивов играет еще более важную роль ввиду возможных побочныхпроцессов взаимодействия.
Ранее удавалось получить удовлетворительные ПЦР результаты налиофилизированных реактивах только для кремниевых микрочипов, так как поверхностькремния являлась полностью инертной. Однако, ПХО подход к модификации поверхностипозволил успешно осуществить лиофилизацию и на алюминиевых микрочипах.В главе 5 решалась основная задача по иммобилизации ОТПЦР-реактивов вмикрореакторах алюминиевого микрочипа. В отличии от ПЦР-регентов, иммобилизацияОТПЦР систем сопровождалась значительными трудностями, которые связаны, вероятно, стермической нестабильностью основного компонента стадии обратной транскрипции ―ревертазы.В процессе лиофилизации ревертазадеградировала настолько, что кажущаясяразница концентраций исходной РНК прианализе одного и того же образца вирусасоставила приблизительно 300 раз.Таким образом, было показано, чтостандартныйнаборстабилизаторовРис.8.
Усредненные кривые ПЦР, полученные влиофилизацииПЦР-реагентовходе исследования влияния процесса лиофилизациина стабильность ревертазы.полимеразойнесмогтолькодлясобеспечитьсохранность двухферментной системы сревертазой (рис. 8).В поисках дополнительной защиты ферментов от конформационных изменений, а такжеот термической деградации в процессе хранения алюминиевых микрочипов и от возможныхэффектов поверхности было найдено, что добавка БСА позволяла лиофилизировать в одноммикрореакторе и полимеразу, и ревертазу. Данную добавку активно используют для улучшенияработы различных белков и ферментов и предотвращения их адгезии к стенкам сосудов врезультате конкурентной сорбции.
Последнее свойство стабилизатора БСА является особенно~ 15 ~важным в данной работе, так как взаимодействие белков с активными центрами поверхности наалюминиевом микрочипе может привести к инактивации ферментов, и как следствие, кингибированию ОТПЦР. Дальнейшее исследование было направлено на подбор оптимальныхконцентраций раствора стабилизаторов на основе трегалозы с добавкой БСА, которыеобеспечивали бы наилучшие показатели работы полимеразы и ревертазы при их одновременнойлиофилизации в смеси с остальными ОТПЦР реагентами в одном микрореакторе.Результаты проверки ингибирования и частичной инактивации компонентов ПЦРвыбранными стабилизаторами в динамических условиях (жидкие реактивы) показали, что припроведении ОТПЦР раствор стабилизаторов с минимальными концентрациями трегалозы (№ 3)обладал наименьшим влиянием на значение пороговых циклов ОТПЦР, при этом использованиеболее концентрированных растворов привело к увеличению Ct.
Такой эффект объясняется тем,что при понижении концентрации стабилизаторов активные центры ферментов инактивируютсяв меньшей степени. Результаты по оптимизации концентрации БСА в смеси ОТПЦР-реактивовпредставлены в табл. 5. Для сравнения значения пороговых циклов ОТПЦР анализпроводили также на жидких реактивах без стабилизаторов.Таблица 5. Значения пороговых циклов ОТ ПЦР нажидких реактивах в зависимости от концентрацииосновных стабилизаторов и добавки стабилизатораБСА на примере анализа реальных образцов вирусаИБК (n = 7, P = 0.95)Из таблицы видно, что минимальныхзначенийпороговыхциклов,атакжемаксимальной воспроизводимости удалосьдостичь, используя раствор стабилизаторовСтабилизатор№3Стабилизатор№2БСА,мг/млСtСt222.20 ± 0.0923.01 ± 0.41оценить0.222.09 ± 0.1023.22 ± 0.58выбранных стабилизаторов и убедиться в0.0222.53 ± 0.1125.15 ± 0.93том, что в пределе выбранных концентраций022.08 ± 0.0822.07 ± 0.37ингибирование ОТПЦР отсутствует.№ 3 с концентрациями БСА 2 и 0,2 мг/мл.Данные о взаимодействии БСА ижидкихОТПЦР-реактивоввлияниепозволилихимическойприродыС другой стороны, понижение концентрации стабилизаторов может привести к неполномузаполнению гидратных оболочек полимеразы и ревертазы и к сокращению сроков храненияалюминиевых микрочипов.
Об эффективности одновременной стабилизации полимеразы иревертазы с помощью выбранных составов в условиях лиофильных реагентов можно судить припроведении реакции на иммобилизированных реагентах, низкого содержания стабилизаторов врастворе № 3 может быть недостаточно для сохранения активности ферментов во времени.При проведении реакции с использованием реактивов, иммобилизированных намикрочипах наибольший аналитический сигнал и минимальные пороговые циклы наблюдались~ 16 ~с раствором стабилизаторов № 2 при добавлении раствора БСА 2 мг/мл.Оценка морфологических характеристик лиофилизата с помощью СЭМ показала, чтокритериям однородного распределения реактивов внутри микрореактора и отсутствиякристалловтрегалозыотвечаливселиофилизированныереагенты,независимоотиспользованных растворов стабилизаторов и БСА.
Все образцы представляли прозрачныестекловидные массы, достаточно прочно удерживающиеся в микрореакторах.Однако, при использовании концентрированного раствора стабилизаторов (№1) ввиду егобольшой вязкости лиофильный остаток представлял отдельные капли на поверхностимикрочипа (рис. 9). Лиофильные остатки на основе более разбавленных растворовстабилизаторов оказались лишены этого отрицательного эффекта и распределились по всейповерхности микрореактора равномерно.абРис. 9. СЭМ изображение иммобилизированных реактивов в ячейке микрочипа с использованием растворастабилизаторов №1 (а) и №2 (б).Проверку сохранения и стабильности ферментативной активности лиофилизированныхОТПЦР-реактивов на поверхности алюминиевых микрочипов проводили методом ускоренногостарения.
В случае ОТПЦР к возможной потере ферментативной активности полимеразы иревертазы при лиофилизации и последующем хранении приводят реакции дезаминирования,гидролиза, конформационные изменения при образовании новых пептидных связей, следствиемкоторыхявляетсяденатурациясамихферментов и ингибирование реакции в целом.~ 17 ~баРис. 10.
а) графики зависимостей порогового цикла от старения микрочипов с иммобилизированными реактивамис использованием раствора стабилизаторов № 3. 1 – добавка раствора БСА 2 мг/мл, 2 – добавка раствора БСА 0.2мг/мл, 3 – добавка раствора БСА 0.02 мг/мл; б) экстраполированные с помощью логистической функции кривые наоснове графиков зависимости порогового цикла от старения микрочипов с иммобилизированными реактивами сиспользованием раствора стабилизаторов № 3По результатам испытаний (рис. 10) все микрочипы, хранившиеся при температуре 35 ᵒС,позволили проводить качественный анализ методом ОТПЦР. Из полученных данных видно, чтонаименьшие пороговые циклы наблюдаются при добавлении к стабилизаторам раствора БСА 2мг/мл, при этом, в течение исследуемого срока старения, нет сильного различия вэффективности стабилизации реактивов при использовании раствора стабилизаторов № 2 или№ 3.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
