Автореферат (1150269), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Инертность алюминиевых микрочипов снанесенными покрытиями тестировали в условиях ПЦР.Для проведения ОТПЦР готовую смесь ПЦР-реактивов закапывали в микрореакторыподготовленногоалюминиевогомикрочипаипомещаливкартриджмикрочиповогоамплификатора нуклеиновых кислот AriaDNA.
Для определения РНК вирусов ИБК и НБустанавливали следующий терморежим ОТПЦР: однократное удержание при 37 °С в течение 20мин (стадия обратной транскрипции); удержание при 94 °С в течение 180 с; термоциклирование(45‒50 циклов): 5 с при 94 °С (денатурация), затем 20 с при 58 °С (отжиг праймеров иэлонгация). В случае проведения анализа с лиофилизированными реактивами раствор пробы иПЦР-буфера смешивали в соотношении 9:1 (например, для 30-луночного микрочипа смешивали18 мкл пробы с 2 мкл ПЦР-буфера) и раскапывали в микрореакторы.Для иммобилизации реагентов в микрореакторах алюминиевых микрочипов методомлиофилизации в качестве рабочей камеры установки был выбран вакуумный эксикатор объемом~8~4 л, позволяющий разместить хладагент и 16 микрочипов в металлических планшетах (рис.
2).Стеклянные стенки эксикатора и керамическая подставка обеспечивали достаточнуютеплоизоляцию, сохраняя низкую температуру хладагента. Пониженное давление создавалосьпри помощи подсоединенного к эксикатору насоса (Varian SD 40), позволяющего работать смикрообъемами раствора без использования конденсора.Рис.
2. Установка для лиофилизации реактивов валюминиевыхподставке(1)микрочипах.находилсяНакерамическойхладагент(2),наповерхность хладагента помещены микрочипы (3), вт. ч. и термочип (4), давление контролировалось спомощью вакуумметра (5).Условия проведения иммобилизациипри пониженном давлении и температурепоказаны на рис.3, из которого следует, чтосконструированнаядобитьсяустановкалиофилизациитемпературанепозволилареактивов,поднималасьРис.
3.Графикизависимостидесятичноготаклогарифма давления (а) и температуры (б) отвышевремени внутри рабочей камеры для лиофилизациитемпературы замерзания растворов (‒ 2 ᵒС).ПЦР-реагентов.Для одновременной стабилизации ревертазы и полимеразы внутри одного микрореактора, атакже для стабилизации синтетических плазмид вирусов и инактивированных вакциниспользовали смесь стабилизаторов (трегалоза, ТВИН-20, поливинилпироллидон ПВП) вразных концентрациях, а также добавку БСА.
В таблице 2 приведены соотношения ПЦРреактивов для приготовления исходной смеси реактивов для лиофилизации.~9~Таблица 2. Составы реактивов и растворов для иммобилизации реактивов внутримикрореакторов алюминиевого микрочипа из расчета на 1 микрочип (30 микрореакторов)Номер смеси, компонент, мклРаствор основных стабилизаторов(Трегалоза: 55.20, 27.60, 13.80 ммоль/л, ТВИН-20: 4.40, 2.20,1.10 ммоль/л, ПВП: 7.60, 3.78, 1.90 ммоль/л)Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ), 2,5 мМTaq Полимераза, 5 ед./мклРевертаза, 5 ед./мклРаствор прямого и обратного праймеров и зондов, 2,5 нМВода деионизированнаяРаствор БСА, от 0,2 до 20 мкг/млПлазмида или вакцина вирусов птиц123457.507.507.507.507.503.75 3.75 3.75 3.75 3.750.75 0.75 0.75 0.75 0.750.750.75 0.75 0.753.60 3.60 3.60 3.60 3.6014.55 15.3014.55 14.55 14.5518.0 18.0-Для выделения РНК из реальных образцов (пассажи патологического материала вирусовптиц НБ и ИБК) использовали коммерческие наборы «Рибо-ПРЕП» и «Рибо-СОРБ», а такжеадаптированную методику на основе сорбции НК на поверхности магнитного сорбента(«Силекс», Россия) со слоем оксида кремния.Несмотря на то, что алюминиевые микрочипы являются гораздо более технологичными впроизводстве, их использование в ОТПЦР затруднялось ввиду прохождения на поверхностимикрореаторов реакции частичного растворения металла в ПЦР-буфере с образованиемгазообразныхпродуктов.Даннаяреакциясопровождаласьтакжезатруднительнымдетектированием флуоресценции и значительно снижала аналитические характеристикиОТПЦР РВ (рис.4).Во избежание таких процессов следовало инактивировать поверхность алюминия, но приэтом сохранить его теплопроводящие свойства, которые крайне важны для ОТПЦР.
В третьейглаве работы рассмотрен синтез тонких пленок на поверхности алюминиевых микрочиповметодом плазмохимического осаждения, а также приведены результаты их исследования спомощью разнообразных методов. Известно, что при прямой модификации металловуглеводородами образуется связь М-С, которая со временем гидролизуется. Более устойчивоепокрытие возможно получить на основе связей М-О-Si…C. В работе проведен двухстадийныйПХО-синтез с использованием различных мономеров.Для выявления возможной зависимости инертных свойств покрытий от условий ихнанесения была получена серия из шести образцов, условно обозначены буквами A-F сразличным временем нанесения (2‒20 мин) и мощностью (20‒80 Вт) осаждения в плазмеацетилена.
Для того, чтобы сохранить гидрофильность поверхности, последней стадией ПХОстала обработка в плазме кислорода (стадия 5) в течение 6 с, во избежание деструкциипокрытия.~ 10 ~Чтобы количественно оценить степеньинертностиполученныхпокрытийвусловиях ОТПЦР, создана приближеннаяматематическая модель, которая позволиласравниватькачествоповерхностиалюминиевых микрочипов, обработанныхразными способами. В рамках этой модели спомощьючисленныхкоэффициентовоценили влияние отдельно взятого пузырькана флуоресцентный сигнал, полученный изконкретного микрореактора в микрочипе.КоличествопомощьюРис. 4. Визуальная оценка инертности поверхностиПЦР-микрочипа при нагреве модельного раствора допузырьковфиксировалицифрового объектива.сРежимтермоциклирования модельного растворасостоял из двух температурных ступеней:94 ᵒС в течение 2 мин: а – необработанная пластинапредварительный прогрев в течение 20 салюминия, б – образец, модифицированный в плазме.при85°Синепосредственноступеньплавления — 120 с при 94 °С.Согласно предложенноймоделивеличина F отражала активностьповерхностиследующим образом: чем больше значение F, тем больше газообразных продуктов фиксируетсяна поверхности микрочипа и тем хуже работает предложенное покрытие в условияхфлуоресцентного детектирования ОТПЦР.
Ввиду разного размера пузырьков были введеныпоправочные коэффициенты, которые отражали бы степень влияния пузырька на величинуфлуоресценции. Таким образом,, гдеS85 – количество пузырьков, занимающих меньше ¼ ячейки, при 85 °С; S94 - количествопузырьков, занимающих меньше ¼ ячейки, при 94 °С; L85 - количество пузырьков, занимающихбольше ¼ ячейки, при 85 °С; L94 - количество пузырьков, занимающих больше ¼ ячейки, при94 °С;B –число ячеек, характеризующихся непрерывным выделением пузырьков.Предложенная модель показала результаты, хорошо согласующиеся с характером фоновых~ 11 ~кривых в модельных ПЦР. На диаграмме (рис. 5) показаны величины F, полученные длямикрочипов с разной обработкой поверхности.Усреднение86порезультатамбылоFизмеренийсерии одинаковых микрочипов для каждого5покрытия.4Fпроизведеновеличины7321234O2C7H8 Triton X-100 C7H16издиаграммы,величина F для необработанных пластинповерхности50Bare Al C8H17OHвиднопринимает очень маленькие значения.
На61Какi-PrOH ((CH3)3Si)2Oнаблюдаетсяисходныхсильноеобразцовгазообразование,проведение ОТПЦР характеризуется оченьРис. 5. Диаграмма значений величины F дляпленок, полученных методом ПХО: 1— контрольныйобразец: необработанный алюминий, 2— октанол, 3— контрольный образец: очищенный алюминий вплазме, 4 — толуол, 5 — Тритон Х-100, 6 — гептан,7— изопропанол, 8 — ГМДС.сильнымиколебаниямифона.Плазмохимическая обработка микрочипов сприменениемГМДСпривелакмаксимальному значению F на первойстадии модифицирования поверхности.Пленки, полученные двухстадийным синтезом на основе ГМДС и ацетилена непоказывали ухудшений своих защитных свойств в процессе хранения микрочипов, чтосвидетельствует об отсутствии деструктивных окислительных процессовс участиемполученных полимеров, в отличии от пленок, полученных в плазме гептана, октанола идр.Исследования полученных покрытий с помощью спектроскопии электрохимическогоимпеданса (ЭИС) также свидетельствуют о высокой степени инертности обработаннойповерхности в случае использования в качестве мономеров для ПХО ГМДС для первой стадиимодифицирования и ацетилена для придания конечному покрытию алмазоподобных свойств(рис.6).~ 12 ~Z (A)Z (B)Z (C)Z (D)Z (E)Z (F)|Z| bare Al|Z| Al in Ar/O2 plazma1000000|Z|, Om1000001000010001000,11101001000100001000001000000n, HzРис.6.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
