Диссертация (1150270)
Текст из файла
САНКТПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиСУВОРОВААлександра ОлеговнаМИКРОЧИПОВАЯ АНАЛИТИЧЕСКАЯ СИСТЕМА ДЛЯ ОБНАРУЖЕНИЯРИБОНУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ПОМОЩЬЮ ЛИОФИЛИЗИРОВАННЫХ РЕАКТИВОВМЕТОДОМ ПЦР С ОБРАТНОЙ ТРАНСКРИПЦИЕЙСпециальность 02.00.02 – аналитическая химияНаучный руководитель:д.ф-м.н. Ганеев Александр АхатовичДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукСанкт-Петербург2015~2~ОГЛАВЛЕНИЕВведение…………………………………………….…………………………….…………………...6I. Обзор литературы……………………………….………………………………….…………........10I.1. Полимеразная цепная реакция……………………………………………………………….......10I.1.1.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией.………………………………....11I.1.2. Методы детектирования продуктов ПЦР.…………….…………………………….………...13I.2. Микрочиповые технологии в аналитической практике и в методе ПЦР…………..…………18I.2.1. Особенности использования микрочиповых технологий для проведения ОТПЦР.…….....20I.3. Способы модифицирования и пассивации поверхности алюминиевых ОТПЦР микрочипов иметоды исследования полученных пленок……………………………..…………………………...22I.3.1. Классические методы обработки поверхности алюминиевых изделий.……........................22I.3.2.
Плазмохимическое осаждение пленок из газовой фазы.………………………….……..…..23I.3.3. Механизмы плазмохимического осаждения.………………………………………………....24I.3.4. Основные реакции ПХО, используемые для модификации поверхности алюминия..….....26I.3.5. Электрохимическая импедансная спектроскопия для оценки инертности пленок наповерхности металлов.………………………………………………………………………………..28I.3.6. Исследование морфологической структуры пленок методом сканирующей электронноймикроскопии (СЭМ) с последующим рентгеноспектральным микроанализом….…………..…..33I.3.7. Оценка структуры покрытий методом спектроскопии комбинационного рассеяния(Raman)……………………………………………………………………………………...…..……..34I.4.
Иммобилизация ПЦР реактивов на поверхности пробирок и микрофлюидныхустройств……………………………………………………………………………………………...35I.4.1. Лиофилизация как метод сушки биологически активных веществ: принцип, преимуществаи недостатки……………………………………………………………………………………….…..36I.4.2. Основные особенности лиофилизации белков……………………………………...………..39I.4.3. Основные стабилизаторы для ПЦР компонентов…………………………………...………..42I.4.4. Особенности применения метода лиофилизации для ПЦР-реактивов……………....……..45I.5 Методы выделения нуклеиновых кислот………………………………………..………….…...46I.5.1.
Классические методы выделения нуклеиновых кислот…………………………….………..46I.5.2. Выделение нуклеиновых кислот с помощью магнитных частиц………………….………..47I.6. Основные сведения о болезни Ньюкасла и Инфекционном бронхите кур……….…………..50I.6.1. Классические методы определения вирусов НБ и ИБК…………………………….………..52I.6.2. Иммуноферментный метод определения вирусов НБ и ИБК………………………...……..54II. Аппаратура, методики и техника экспериментов…………………………………..…...............56~3~II.1.
Топология и устройство алюминиевого микрочипа..………………………..…………..........56II.2. Изготовление алюминиевого микрочипа..………………………………………………..........57II.2.1. Оборудование для изготовления микрочипов.………………………………………………57II.2.2. Реактивы для изготовления микрочипов…………………………………...…………..……57II.2.3. Стадия 1: предварительная подготовка поверхности алюминиевой подложки………..…58II.2.4. Стадия 2: плазменная обработка алюминиевой подложки…………………………………58II.2.5. Стадия 3а: гидрофилизация поверхности алюминиевой подложки……….………………58II.2.6. Стадия 3б: Гидрофобизация внешней (между микрореакторами) поверхностиалюминиевой подложки …………………………………………………………………………..…59II.2.7.
Стадия 4: соединение готовой алюминиевой подложки с пластмассовой рамкой ………59II.3. Плазмохимическое осаждение покрытий на поверхности алюминиевой пластины и методыисследования полученных пленок…………………………………………………………………..60II.3.1. Оборудование и реактивы для ПХО………………………………………………………….60II.3.2. Методика проведения ПХО на поверхности алюминиевых микрочипов………….…….61II.3.3. Исследование инертности покрытий в условиях ПЦР методом спектроскопииэлектрохимического импеданса………………………………………………………………….….63II.3.4.
Измерение угла смачивания поверхности микрочипов водой методом растекающейсякапли…………………………………………………………………………………………………...64II.3.5. Исследование морфологической структуры и оценка элементного состава пленокметодами сканирующей электронной микроскопии и рентгеновского энергодисперсионногомикроанализа…………………………………………………………………………………….……65II.3.6. Исследование структуры пленок методом спектроскопии комбинационного рассеяния(Raman)…………………………………………………………………………………………...……66II.4. Методы пробоподготовки биологического материала………………..……………………...66II.4.1.
Выделение РНК из биологического материала с помощью коммерческого комплектареагентов "АмплиПрайм РИБО-преп"…………………………………………………….………...67II.4.2. Выделение РНК из биологического материала с помощью комплекта реагентов"АмплиПрайм РИБО-сорб"……………………………………………………………………...…...68II.4.3. Выделение РНК из биологического материала с помощью магнитных частиц..………....70II.5.
Проведение ОТПЦР с помощью микрочипового анализатора AriaDNA….…………..…….73II.5.1. Проведение ОТПЦР на жидких реактивах………………………………………….……….73II.5.2. Проведение ОТПЦР c иммобилизированными реактивами ……………………………….75II.6. Иммобилизация ОТПЦР-реагентов внутри микрореакторов алюминиевого микрочипа спомощью экспериментальной лиофильной установки ……………….…………………………...76~4~II.6.1. Экспериментальная установка для иммобилизации ОТПЦР реактивов…………………...76II.6.2. Методика приготовления растворов стабилизаторов.……………………………………...78II.6.3. Приготовление полной смеси ПЦР- и ОТПЦР-реактивов для лиофилизации..…………...79II.6.4.
Методика иммобилизации реактивов внутри ячеек алюминиевого микрочипа……...…...79II.6.5. Методика искусственного старения микрочипов с иммобилизированными реагентам.....80II.7. Исследование морфологической структуры лиофильных пленок методом сканирующейэлектронной микроскопии ………………………………...………………………………………...81III. Результаты плазмохимического осаждения пленок на поверхности алюминиевыхмикрочипов………………………………………………………………………………………..…..82III.1. Оценка инертности углеродсодержащих покрытий в условиях ПЦР………………..……..83III.2. Исследование углеродсодержащих пленок с помощью спектроскопии электрохимическогоимпеданса……………………………………………………………………………………………...87III.3.
Исследование морфологических свойств покрытий методом сканирующей электронноймикроскопии и оценка состава полученных пленок методом рентгеновскойэнергодисперсионной спектроскопии ……………………………………………...……………….90III.4.Оценка состава покрытия методом спектроскопии комбинационного рассеяния(Raman)…………………………………………………………………………………………..…….96III.5.Измерение контактного угла смачивания поверхности микрочипов водой……….….…….98III.6.Проведение ОТПЦР на микрочипах с нанесенными углеродсодержащими пленками сиспользованием микрочипового ПЦР-анализатора ……………………………………….………99IV.Подбор оптимальных физических условий для иммобилизации ПЦР реагентов наповерхности алюминиевых микрочипов на примере ДНК-систем………………..……….…….102IV.1. Оптимизация методики модификации поверхности подложки микрочипа………….…...102IV.2.
Оптимизация условий для экспериментальной установки для иммобилизацииреактивов……………………………………………………………………………………………..105IV.3. Оптимизация времени лиофилизации ПЦР-реагентов в экспериментальной установке ..107IV.4. Сравнение методов иммобилизации ПЦР-реагентов на поверхности алюминиевыхмикрочипов………………………………….……………………………………………………….108IV.5. Проверка длительности хранения лиофилизированных реактивов для ПЦР-анализапроб…………………………………………………………………………………………………...112V.Иммобилизация ОТПЦР реактивов в микрореакторах алюминиевого микрочипа……….….114V.1.Исследование влияния процесса лиофилизации на активность ревертазы ..……………….114V.2 Исследование влияния модельной смеси стабилизаторов на ОТПЦР реактивы в жидкойформе …………………………………………………..…………………………………………….117~5~V.3.Результаты лиофилизации ОТПЦР-реактивов с модельной смесью стабилизаторов….....122V.4 Исследование эффективности стабилизации иммобилизированных ОТПЦР-реактивов взависимости от времени хранения...................................................................................................127V.5 Исследование стабилизации положительного РНК контроля в процессе искусственногостарения..............................................................................................................................................132VI.
Оптимизация пробоподготовки вирусных пассажей на курином эмбрионе.........................137VI.1. Оптимизация температуры и времени лизиса клеток для схемы пробоподготовки наоснове суспензии магнитного сорбента...........................................................................................138VI.2 Оптимизация стадии сорбции РНК на поверхности магнитного сорбента..........................142VI.3. Очистка сорбента от гидрофильных и гидрофобных ингибиторов.....................................143VI.4. Оптимизация стадии элюирования РНК с магнитного сорбента……………….……...…..146Выводы…………………………………………………………………………………….…………152Перечень используемых сокращений…………………………………………..………………….153Литература……………………………………………………………………………………….…..154~6~ВВЕДЕНИЕМолекулярно-генетическиеметодыявляютсяоднимизважнейшихнаправлений в современной аналитической химии. Для определения нуклеиновыхкислот наиболее широкое распространение получила полимеразная цепнаяреакция(ПЦР),котораяобладаетуникальнымианалитическимихарактеристиками, такими как: высокая чувствительность, экспрессность ивысокая специфичность к нуклеиновым кислотам.
В качестве варианта этогометода для анализа объектов, содержащих вирусы на основе рибонуклеиновыхкислот(РНК),применяетсяПЦРсдополнительнойстадиейобратнойтранскрипции (ОТПЦР). Данная стадия позволяет превратить искомую РНК вкомплементарную ДНК (кДНК), пригодную для дальнейшего определения поклассической схеме ПЦР.В последние годы широкое распространение для осуществления ПЦР нашлимикрочиповые технологии.
Но до сих пор предложено очень небольшоеколичество микрочиповых аналитических приложений, в которых реализованОТПЦР. Более того, ввиду нестабильности двухферментной системы ПЦРреактивов, содержащей ревертазу и полимеразу вместе, в микрочиповых системахспособ лиофилизации ОТПЦР-реактивов внутри микрореакторов практически неприменяется.ПриэтоммногократноепипетированиеОТПЦР-реактивовзначительно увеличивает трудозатраты метода и сокращает возможностиприменения ОТПЦР в полевых условиях. Таким образом, существует потребностьв разработке новых микрочиповых систем с лиофилизированными ОТПЦРреактивами для их последующего применения в таких областях как ветеринарныйконтроль, рыбоводство, птицеводство, ввиду большого количества вирусныхвозбудителей, которые необходимо оперативно обнаруживать в различныхобъектах аналитического контроля.Цельюнастоящейработыявиласьразработкамикрочиповойаналитической системы с иммобилизированными реактивами в микрореакторахалюминиевого микрочипа для определения РНК методом ОТПЦР на примере~7~обнаружения вирусов птиц и ее практическая апробация на реальных объектах.Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующиеосновные задачи:1.Найти условия модификации свойств поверхности алюминиевыхмикрочипов с помощью плазмохимического синтеза углеродсодержащих пленокдля обеспечения эффективной лиофилизации реактивов.2.Провести исследования свойств полученных покрытий: инертности иустойчивости в условиях проведения ОТПЦР.3.Разработатьэкспериментальнуюустановкудлялиофилизацииреактивов и обеспечить оптимальные параметры процесса на примере тест-системдля определения ДНК.4.Обосновать выбор стабилизаторов для одновременной лиофилизацииревертазы и полимеразы в микрореакторах алюминиевых микрочипов, иоптимизировать их концентрации для обеспечения длительных сроков хранениямикрочипов с лиофилизированными реактивами.5.Оптимизироватьметодикупробоподготовкивируссодержащихбиологических материалов для обеспечения мобильности и экспрессностипредлагаемой аналитической системы.Научная новизна.1.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
