Диссертация (1150270), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Предложен новый способ модификации поверхности алюминиевых микрочиповс помощью плазменного осаждения полимеров из газовой фазы, обеспечивающийвозможность иммобилизации реактивов, необходимых для определения РНКвирусов методом ОТПЦР.2.ДостигнутывысокиезначенияэффективностиОТПЦР(до98%)симмобилизированными реактивами в микрореакторах алюминиевого микрочипа,модифицированного предложенным способом, на примере обнаружения вирусовптиц.~8~3. Разработан способ лиофилизации всех компонентов ОТПЦР, включаяполимеразу и ревертазу, а также плазмиды и вакцины вирусов в микрореакторахмодифицированных алюминиевых микрочипов с помощью добавки бычьегосывороточногоальбуминадинамическогопассиватора,(БСА)чтовсмесьпозволилостабилизаторовобеспечитьвкачестведолговременнуюстабильность микрочипов при хранении в течение 8 месяцев.Практическая значимость работы.1.
Разработан макет микрочипа с иммобилизированными реактивами дляопределения РНК методом ОТПЦР в режиме реального времени (ОТПЦРРВ) на примере обнаружения вирусов птиц.2. Разработана принципиальная схема методики пробоподготовки на основесуспензии магнитного сорбента для определения РНК с помощьюмикрочиповой ОТПЦР, позволяющая проводить анализ в полевых условиях.3.
На примере обнаружения вирусов птиц в реальных образцах показано, чторазработанный микрочип позволяет значительно сократить затраты надорогостоящиереактивы,упроститьработуоператораиснизитьвероятность кросс-контаминации образцов.Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи и 9 тезисовдокладов.Апробация работы. Результаты работы представлены в виде докладов наследующих научных мероприятиях: World Congress on Engineering and TechnologyCET 2012 (Пекин, 2012), 1-ой Зимней молодежной школе–конференции смеждународным участием «Новые методы аналитической химии» (СанктПетербург, 2013), VII Всероссийской конференции «Менделеев – 2013» (СанктПетербург, 2013), VIII Всероссийской конференции «Менделеев – 2014» (СанктПетербург,2014), 97th Canadian Chemistry Conference and Exhibition: "Chemistryfrom Sea to Sky" (Ванкувер, 2014), III Всероссийской студенческой конференции смеждународным участием, посвященной 140-летию со дня рождения химика–~9~органика Ю.С.
Залькинда (Санкт-Петербург, 2015).Положения и результаты, выносимые на защиту:1.Основныепринципымодификацииповерхностиалюминиевыхмикрочипов с помощью плазменного осаждения полимеров из газовой фазы,способствующие дальнейшей иммобилизации реактивов, необходимых дляопределения РНК-вирусов методом ОТПЦР, в микрореакторах.2.УсловиялиофилизациивсехкомпонентовОТПЦРвнутримикрореакторов модифицированного алюминиевого микрочипа, позволяющиеобеспечить высокие значения эффективности ОТПЦР на примере обнаружениявирусов птиц.3.Состав стабилизаторов для лиофилизации всех компонентов ОТПЦР,включая полимеразу и ревертазу, а также плазмиды и вакцины вирусов вмикрореакторах модифицированных алюминиевых микрочипов, с помощьюдобавки бычьего сывороточного альбумина (БСА).4.Результаты прямого обнаружения вирусов птиц в реальных образцах спомощью разработанного микрочипа и пробоподготовки с использованиемсуспензии магнитного сорбента.Личный вклад автора.
Авторский вклад состоит в выборе стратегиирешения основных задач и их экспериментальной реализации, в обработке иоформлении полученных результатов, анализе и обобщении полученных данных иформулировании основных выводов.~ 10 ~I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫI.1 Полимеразная цепная реакцияПолимеразная цепная реакция представляет собой ферментативный синтезопределенного участка дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) с заданнойнуклеотидной последовательностью. Высокая специфичность и чувствительностьПЦР позволяют использовать этот метод для диагностики наследственных иинфекционных заболеваний, обнаружения генетически модифицированныхорганизмов и чужеродного генетического материала в продуктах питания [1, 2].ПЦР проводится в условиях повторяющихся температурных циклов синтезаучастка ДНК, что приводит к геометрическому росту (амплификации) количествакопий этого участка ДНК (ампликонов) в растворе [3, 4].
Управление физикохимическимипроцессамиосуществляетсяпутемизменениятемпературыреакционной смеси (температурный режим) в определенном порядке (рис. 1).Рис. 1 Схематичное изображение процессов, происходящих при одном температурном циклеПЦР [3].При повышении температуры до 94 °С двухцепочечная молекула ДНКдиссоциирует на две одноцепочечные (стадия денатурации). Полученные нитивыступают матрицами для синтеза последующих комплементарных цепочек. Припонижении температуры до 53–68 °С (стадия гибридизации) к комплементарным~ 11 ~участкамодноцепочечныхмолекулДНКприсоединяютсякороткиеолигонуклеотиды. Далее температуру реакционной смеси повышают до 72 °С —оптимальной температуры для ферментативного синтеза комплементарнойнуклеотидной последовательности (стадия элонгации).
В результате одноготакого цикла число фрагментов ДНК удваивается (образуются ампликоны), примногократном повторении таких циклов происходит рост их количества вгеометрической прогрессии [5].Одним из главных компонентов, которые необходимы для проведения ПЦР врастворе является ДНК-полимераза — основной фермент, который осуществляетсинтез комплементарной последовательности. и должен сохранять активностьпосле инкубации при 95 °С. Чаще всего в аналитической практике применяютTaq-полимеразу, которую выделяют из термофильной эубактерии Thermusaquaticus.
В качестве регулятора среды используют реакционный буфер (с Mg2+),который создает оптимальные условия для работы полимеразы, так как ионымагнияявляютсякоферментомДНК-полимеразы.Дезоксирибонуклеозидтрифосфаты (дНТФ) dATP, dGTP, dCTP, dTTP выступаютв качестве «строительного материала» для синтеза комплементарной цепи ДНК.Для ограничения амплифицируемого участка используют праймеры — короткиеолигонуклеотиды,которыегибридизациислужатиприсоединяютсясвоеобразнымикДНК-мишенямзатравкамидлянастадииначалаработыполимеразы. Так как полимераза способна взаимодействовать только с ДНК,использовать такую реакцию для анализа рибонуклеиновых принципиальноневозможно.I.1.1.
Полимеразная цепная реакция с обратной транскрипциейПолимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТПЦР)позволяет использовать в качестве исходных молекул для их многократнойамплификации рибонуклеиновые кислоты (РНК), что значительно расширяетколичество объектов, анализируемых методом ПЦР.~ 12 ~ДопоявленияиспользовалсяОТПЦРметоддлясеверногоколичественногоблоттинга,анализакоторыйРНКширокооснованнаиммунохимическом принципе [6]. Данный метод обладал значительнымиограничениями, трудоемкостью, требовал большого количества исходной РНК ибыл неточным [7].
В настоящее время ОТПЦР повсеместно заменяет блоттинг.Принцип ОТПЦР (рис. 2) заключается в том, что молекула РНК сначалатранскрибируется в кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы).После стадии обратной транскрипции полученные молекулы комплементарнойДНК (кДНК) уже могут амплифицироваться с помощью стандартной ПЦР.Для проведения обратной транскрипции в реакционной смеси также должныприсутствовать праймеры в качестве затравки и смесь четырех дНТФ, в качествестроительного материала.Рис. 2. Принципиальная схема реакция обратной транскрипции.В аналитической практике используют два подхода для проведения ОТПЦР.Реакция обратной транскрипции проводится либо в отдельной пробирке(двухстадийная ОТПЦР), либо в той же самой пробирке, что и последующая ПЦР(одностадийная ОТПЦР) [8]. Основным преимуществом двухстадийного вариантаявляется возможность сохранения комплементарной ДНК для последующего~ 13 ~использования (клонирования, определения последовательности и т.
п.) а такжебольшаяточностьполученныхрезультатов.Однакоприпроведенииодностадийной ОТПЦР вероятность ошибок экспериментатора существенноснижается, кросс-контаминация и случайный разброс параметров реакциисводятся у минимуму, поскольку обе реакции проходят в одной емкости.На данный момент ОТПЦР является самым удобным инструментом дляисследованияаналитическимиианализаРНК,такхарактеристиками:какобладаетвысокойнепревзойденнымичувствительностьюиспецифичностью, широким диапазоном определяемых концентраций (более 7порядков), возможностью одновременного количественного и качественногоанализа [9].
В настоящее время разработано множество разнообразных ОТПЦРметодик для широчайшего круга объектов и аналитических задач: от определенияколичества дрожжей в вине [10] до анализа вируса гриппа в крови [11].I.1.2. Методы детектирования продуктов ПЦРСреди методов детектирования ампликонов, синтезированных в результатеПЦР и ОТПЦР, наиболее распространенными являются метод электрофореза иметоды гибридизации продуктов ПЦР с зондами после (методы конечной точки[12]) и в процессе амплификации (режим реального времени [13]).В основе электрофоретического метода лежит разделение молекул ДНК\РНКпо размеру (рис.
3) в пластине агарозного или полиакриламидного геля,содержащего краситель, например бромистый этидий, который встраивается(интеркалирует) плоскостными группами в молекулы нуклеиновой кислоты (НК).Пластину геля помещают в аппарат для гель-электрофореза и подключаютисточник постоянного напряжения. Отрицательно заряженная НК начинаетдвигаться в геле от отрицательно заряженного электрода к положительнозаряженному, при этом более короткие молекулы НК движутся быстрее, чемдлинные.~ 14 ~Рис.
3 Пример разделения молекул НК в агарозном геле [9].Стоит отметить, что данный метод детектирования позволяет осуществлятьтолько качественный ПЦР анализ и обладает такими недостатками, как большиевременные затраты, невозможность автоматизации, сложность и субъективностьтрактовки результатов, а также высокий риск контаминации.С другой стороны, методика ПЦР в режиме реального времени (ПЦР РВ)позволяет количественно определять искомые аналиты благодаря регистрацииизменения интенсивности флуоресценции особых зондов. Выделяютдвеосновные группы зондов: неспецифический Сайбер грин (SYBR Green) испецифические TaqMan зонды.Молекула SYBR Green в процессе связывания с двухцепочечной ДНКначинает флуоресцировать под действием возбуждающего излучения [12], приэтом интенсивность флуоресценции растет с накоплением продуктов ПЦР.Следует отметить, что такой краситель также присоединяется к неспецифичнымпобочным продуктам реакции, таким как праймер–даймер и др., однако этонаиболее экономичный и простой в использовании зонд [13].Специфичностьфлуоресцентно-меченныхзондовобуславливаетсяолигонуклеотидной последовательностью, которая комплементарна участку вмолекуле ампликона, поэтому они являются селективными индикаторами именно~ 15 ~на нуклеотидную последовательность амплифицируемого участка ДНК.
Taqmanзонды представляют собой олигонуклеотиды, которые имеют флуоресцентныйзонд, присоединенный к 5' концу и тушитель, присоединенный к 3' концу. Вовремя амплификации зонд связывается с целевой последовательностью ДНК иликДНК. В результате 5'–нуклеазой активности полимераза расщепляет связь зондолигонуклеотид, что приводит к пропорциональному росту флуоресценции [14,15]. Флуоресценция TaqMan зондов зависит от резонансного переноса энергии(FRET) связывания молекулы красителя и тушителя на олигонуклеотидныесубстраты [16]. Правильно подобранные TaqMan зонды обеспечивают оченьточные результаты ОТПЦР. В зависимости от строения структуры «краситель–тушитель» выделяют такие типы зондов как «молекулярные маячки» (molecularbeacons) [17], «скорпионы»(Scorpion Probes ) [18], гибридизационные зонды(Multiplex Probes) [19] и др.Кроме того, концевые последовательности зонда также представляют собойвзаимно комплементарные области, а флуорофор и тушитель присоединяют кконцевым нуклеотидам (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
