Диссертация (1150270), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Большое количество таких операций приподготовке образцов увеличивает риск ошибки оператора, а также затрудняетпроведение анализа в полевых условиях.Для того чтобы еще больше повысить производительность и надежностьмикрочиповых ОТПЦР систем, в последнее время стал распространяться подход кразработке лиофилизированных ПЦР-реагентов в микрореакторах или каналахмикрочипа. Таким образом, вероятность ошибки оператора иликросс-контаминации образцов (загрязнение отрицательного образца положительнымобразцом, приводящие к ложноположительным результатам)сводится кминимуму.
В работе [72] предложен автономный одноразовый поликарбонатныймикрофлюидный картридж, для обнаружения нуклеиновых кислот. Такая система~ 36 ~могла работать полностью автоматически за счет того, что все жидкости и сухиереагенты, необходимые для реакций предварительно помещены в кассету.I.4.1. Лиофилизация как метод сушки биологически активных веществ:принцип, преимущества и недостаткиСуществует большое количество подходов к высушиванию реагентов,например высушиваниена воздухе при обычной температуре, при низкойтемпературе под уменьшенным давлением, высушивание в атмосфере инертногогаза и т.д. Наиболее важным методом, который используют для подготовкитермолабильных веществ, является лиофилизация. За счет отсутствия воздействиявысоких температур на препарат, сохранения дисперсной фазы препарата ивозможностииспользованиялетучихрастворителейметодлиофилизациипозволяет получать сухие ткани, препараты, продукты и т.
п. без потери ихструктурной целостности и биологической активности.Процесс лиофилизации основан на сублимации. В случае биологическихпрепаратов основным растворителем для лиофилизируемых веществ выступаетвода [73]. Согласно фазовой диаграмме (рис. 14), для того, чтобы перевести водуиз твердого состояния в газообразное, необходимо, поддерживая давление ниже0.06 атм. не поднимать температуру выше 0 °С. Такие условия являютсяграничным для лиофилизации водных растворов биологических веществ.Рис. 14 Фазовая диаграмма воды [115].~ 37 ~Рис.
15. Диаграмма полного цикла лиофилизации, включающего первичную и вторичнуюсушку. На графике указаны температуры стационарных участков и самого лиофилизирумогоматериала, а также давление в рабочей камере [115].Лиофилизация (рис. 15) состоит из трех последовательных стадий, а именнопредварительногозамораживанияпрепарата,первичноговысушиванияидосушивания.На этапе заморозки происходит замораживание материала. В лабораторияхзамораживание производят в смесях льда с солью, сухого льда со спиртом илиацетоном, в жидком азоте; в промышленности используют низкотемпературныехолодильные шкафы. На этом этапе очень важно, чтобы охлаждение материалапроисходило ниже эвтектической точки.
Это условие гарантирует, что вследующем шаге будет происходить сублимация растворителя, а не егоплавление.Во время этапа первичной сушки давление снижается (в диапазоненескольких миллибар), и к материалу поступает достаточно тепла для сублимацииводы. В процессе этого начального этапа сушки удается сублимировать большееколичество воды (около 95%).~ 38 ~Этап вторичной сушки нацелен на то, чтобы удалить связанные молекулыводы и регулируется изотермой адсорбции материала. В этой фазе температураподнимается выше, чем на этапе первичной сушки, вследствие чего нарушаютсяфизико-химические взаимодействия между молекулами воды и замороженнымивеществами. В отдельных случаях на этой стадии применяют специальныехимические поглотители (Р2O5) и высоковакуумные диффузионные насосы вдополнение к насосам и поглотителям, используемым на стадии удалениясвободной воды. В конце операции, окончательное остаточное содержание воды впродукте составляет от 1% до 4%, что является чрезвычайно низким показателем[74].
Полученный лиофилизат крайне гигроскопичен, и требует дополнительнойзащиты от влаги, кислорода воздуха и света (в случае наличия чувствительныхкомпонентов) [75].Лиофилизация имеет свои преимущества и недостатки, но на данный моментэто наиболее популярный метод сушки биологических веществ. Наиболееважным аспектом лиофилизации применительно к ПЦР-компонентам являетсяэффективное сохранение стабильности белков, за счет подавлениятакихпроцессов, как гидролиз пептидной связи, дезаминирование. Более того, влиофилизате резко снижается активность микроорганизмов, которые могутпривести к деградации препарата [76].Отметим, что для растворения высушенных препаратов требуется небольшоеколичество времени, так как в процессе испарения на поверхности лиофилизатаостаются микропоры, возникающие при сублимации кристалликов льда.
Методлиофилизации выгоден и с экономической точки зрения, так как хранение итрансфер высушенных материалов дешевле, чем их растворенной формы [77].Кроме того, лиофилизация приносит меньше вреда веществам, чем другие методыудаления воды, использующие повышенные температуры.К слабой стороне метода причисляют риск испарения летучих компонентовпод высоким вакуумом, необходимость использования насоса для созданиявакуума.
Стоит отметить, что быстрое зарождение и рост кристалликов льда в~ 39 ~результате переохлаждения ведет к образованию большой ледяной поверхности,которая способна взаимодействовать с белками, что может привести кденатурации. Удаление гидратной оболочки белков в процессе сушки вотсутствии стабилизаторов может привести к дестабилизации структуры белка[78], поэтому для лиофилизации некоторых биологически-активных компонентовтребуется разработка специальных добавок [79].
Одним из самых чувствительныхи сложных компонентов ОТПЦР является именно фермент, поэтому стоитрассмотреть отдельно особенности лиофилизации белков.I.4.2. Основные особенности лиофилизации белковТеоретические аспекты лиофилизации в случае белков довольно сложны.Когда подобная белку биологическая субстанция находится в водном растворе, еемолекулы окружены гидратной оболочкой. Подобная оболочка стабилизируетбелок и способствует сохранению его активности [78]. В процессе сублимацииводы, активные группы белка, обычно прикрытые молекулами воды, открываютсяи могут химически взаимодействовать друг с другом, таким образом, формируяновые пептидные связи, которые способны исказить нативную структуру белка ипривести к сшивке и агрегации белков [80].
Поскольку биологически активнымиявляются именно третичные конформации белков, искажение структуры можетпослужить причиной потери активности в процессе сушки [81].Низкаятемпературапервогоэтапалиофилизациипомогаетсвестинежелательные реакции между активными группами аминокислот к минимуму,лишая их необходимой для реакций энергии.
При этом замороженное состояниебелка имеет меньшую стерическую свободу, по сравнению с раствором, чтоуменьшает склонность к конформационным изменениям.Кроме взаимодействий, приводящих к образованию пептидных связей,лиофилизаты, содержащие низкий процент остаточной воды, все еще могутподвергатьсяинактивирующимхимическимреакциям,протекающимв~ 40 ~присутствии воды и часто должны храниться в морозильной камере, что являетсянеобходимым условием для сохранения их активности [82]. Более того,некоторые белки полностью инактивируются в процессе лиофилизации [83]. Поэтим причинам при высушивании биологически активных веществ, в частностибелков, в лиофильную смесь необходимо вводить стабилизирующие агенты.Лиофильныестабилизаторы–этодобавки,предотвращающиеилизатормаживающие потерю активности белка в процессе лиофилизации. Вкачестве таких добавок используют разнообразные вещества, чаще всегополисахариды, аминокислоты, полиолы и соли.
Некоторые из приведенныхвеществспособныувеличиватьсрокихраненияпрактическиполностьювысушенных ферментов при комнатной температуре до нескольких месяцев идольше. Однако эффективность той или иной предполагаемой добавки зависит отхимического состава биологически активного вещества. В случае белков влияниеоказывают последовательность аминокислот, его вторичная, третичная ичетвертичная структуры [84].
Таким образом, защитная функция конкретныхстабилизаторов для конкретных белков не всегда является предсказуемой. Крометого, влияние на стабильность веществ и время их хранения оказывают такжебуферный раствор, скорость замораживания, давление, температура в начале, впроцессе и в конце процедуры лиофилизации, а также ее продолжительность [85].Часто эффективная стабилизация одного фермента, осуществляемая композициейстабилизаторов, не подходит для другого.
Как результат, большинствокоммерчески доступных лиофилизированных препаратов содержат один ферменти стабилизаторы, сохраняющие его активность.Существуют два предположительных механизма, благодаря которымлиофильные добавки стабилизируют белок в аморфном состоянии:1) Гипотеза замены воды.Данная гипотеза объясняет осуществление стабилизации за счет сохранениянативной структуры белка в сухом состоянии благодаря образованию водородныхсвязеймеждустабилизаторомибелком.Нативнаяконформация~ 41 ~термодинамически более стабильна и, следовательно, более устойчива кдеградации во время хранения. Стабилизация в результате поддержания нативнойструктуры предлагает термодинамическое объяснение механизма стабилизации[86, 87].Доказательства этой гипотезы, основанные на результатах ИК-Фурьеспектроскопии [88], показывают, что отсутствие стабилизатора ведет ксуществованию двух структур: альфа-спирали и бета-складчатой структуры, приэтом альфа-спираль частично переходит в бета-структуру, в которой междупептидными группами также существует водородная связь, но в отличие от аспирали, эти группы удалены друг от друга гораздо дальше.
В присутствии жестабилизатора, равновесие смещено в сторону наиболее стабильной структуры, тоесть альфа-спирали [89].Рис. 16. Трехмерная структура белка: А – альфа-спираль, Б – бета-складчатая структура [3].2) Гипотеза стеклообразования.В соответствии с этой гипотезой, стабилизация белков обеспечивается засчет иммобилизации молекул в твердом состоянии, тем самым подавляютсяперемещения, происходящие в основном из-за поступательных и вращательныхколебаний конформации белка. Это приводитк кинетическому замедлениюдиффузии молекул, которые способны привести к деградации белка [90, 91].~ 42 ~Таким образом, эта теория предлагает объяснение стабилизации с точки зрениякинетики.Существуюткаждойизразличныеэтихгипотез.исследования,Некоторыеанализирующиеавторынаходятправомерностьболееудачнымпрогнозируемость стабильности при хранении исходя из сохранения нативнойструктуры [92, 93], в то время как другие нашли лучшую корреляцию смолекулярной подвижностью [94, 95].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
