Диссертация (1150270), страница 3
Текст из файла (страница 3)
4). При температуре отжига свободные зондыобразуют шпильки за счет наличия комплементарных участков. При этомфлуорофор и тушитель оказываются в непосредственной близости, что приводитк тушению флуоресценции.Рис. 4 Принцип действия флуоресцентно-меченного зонда на примере зонда–шпильки [3].~ 16 ~ПЦР РВ позволяет получать количественные данные о содержании ДНК впробе путем определения порогового цикла по кинетической кривой ПЦР РВ ипостроения градуировочной зависимости [3]. Величина порогового цикла (Ct)определяется как номер цикла, при котором флуоресценция в процессе реакциипревышаетпороговоезначение.ВеличинаCtобратнопропорциональналогарифму первоначального числа копий ДНК и, таким образом, отражает точкунакопления достаточного количества ампликонов.
Кинетическая кривая ПЦР вкоординатах"Уровеньфлуоресценции—цикламплификации"имеетсигмоидную форму (рис. 6).Рис. 5 Зависимость порогового цикла ПЦР от концентрации ДНК.Рис. 6 Кинетические кривые ОТПЦР при различных концентрациях исходной НК. 1 — cо, 2 —cо ×10-1, 3 — cо ×10-2 , 4 — cо ×10-3, 5 — cо ×10-4.~ 17 ~В ходе ПЦР кривой можно выделить три стадии: Стадию инициации (ПЦРпродукты еще не детектируются); Экспоненциальную стадию, в которойнаблюдается экспоненциальная зависимость количества флуоресценции от циклаПЦР); Плато (стадию насыщения).Продолжительность экспоненциальной стадии зависит от концентрации НК иот качества реагентов.
При идеальной реакции с каждой ДНК-мишени в образцеза цикл амплифицируются 2 молекулы. На стадии насыщения эффективностьамплификации снижается (чаще всего после 40 циклов), что обусловленообразованием веществ, приводящих к расщеплению продуктов амплификации,денатурацией полимеразы или присутствием ингибиторов [20, 21].Неоспоримым преимуществом режима реального времени по сравнению сэлектрофоретическимдетектированиемявляетсявозможностьпроведенияколичественного анализа и сокращение числа стадий анализа в случае сложныхобразцов [22].
Однако при этом стоит брать во внимание, что количественнаяПЦР РВ требует дополнительного перевода флуоресцентных сигналов вчисловую форму, что приводит к спорным результатам в некоторых случаях.Несмотря на все преимущества и достоинства определения РНК методомОТПЦР существуют некоторые трудности, связанные с применением данногометода в повседневной аналитической практике. Так, экспоненциальный росткДНК во время множественных циклов ПЦР значительно снижает линейностьсигналафлуоресценциивблизиучастканасыщения[23].Крайняячувствительность ОТПЦР имеет свои побочные эффекты, так как даже малейшеезагрязнение РНК может привести к нежелательным результатам или полномуингибированию реакции [24], поэтому при анализе реальных объектов следуетвыбирать методики пробоподготовки, которые обеспечивают максимальноеочищение пробы перед проведением ОТПЦР.
Кроме того, количественный анализдля некоторых образцов представляет серьезную техническую и аналитическуюзадачу в связи с большим количеством влияющих параметров, таких как~ 18 ~эффективность амплификации и различные матричные эффекты пробы, напримерналичие в образце высоких концентраций ингибирующих компонентов: липидов,полисахаридов, белков, тяжелых металлов [25].Повышение аналитических характеристик метода при проведении ПЦР впластиковых пробирках и планшетах достигло предела в своем развитии, так каксуществующие анализаторы обладают низкими скоростями термоциклирования2–5 °С/с [3] и высокой неравномерностью распределения температур внутриреактора, которые ограничивают время проведения ПЦР 0.8–1.5 ч, а такжехарактеризуются высоким расходом реагентов 20–50 мкл, приводящим к высокойстоимости анализа [26, 27].
При этом производительность анализа в такихприборах как правило ограничена 96–384 одновременно регистрируемымиреакциями. Отметим, что такие характеристики, как скорость изменениятемпературы, равномерность распределения температуры внутри реактора искорость установления этого равновесия, точность поддержания температуры иравномерность распределения температуры по нескольким реакторам, в итогеопределяют специфичность ПЦР, быстродействие анализа, правильность ивоспроизводимость результатов [4].Микрочиповые технологии в аналитической практике и в методе ПЦРI.2.Втечениепоследнихмикроэлектромеханическихдесятилетийсистемсовершенствование(МЭМС)привелоктехнологийпоявлениюминиатюризированных сенсоров и аналитических систем [28, 29, 30].
ТехнологииМЭМС широко используют для создания миниатюризированных устройств длярешения аналитических задач в биологии и медицине [31, 32]. Основнымэлементом микроаналитической системы является химический микрочип –миниатюрное устройство планарной геометрии, в котором создана разветвлённаясеть микроканалов или микрореакторов, выполненное с применением технологий~ 19 ~МЭМС из различных материалов: стекло, кварц, кремний, керамика, полимеры, атакже металлы и их сплавы [30, 28].Высокиеаналитическиехарактеристикимикрочиповыхсистемпродемонстрированы для систем анализа, реализующих электрокинетические ихроматографические методы разделения, методы жидкостно–жидкостной итвердофазной экстракции, электрохимические методы, а также биохимические ииммуноферментные методы [33, 34].Микрочиповые аналитические системы, которые реализуют молекулярногенетический анализ нуклеиновых кислот (ДНК и РНК) давно привлекаютзначительный интерес исследователей [3, 4].
В настоящее время активноразрабатываются новые методы, основанные на применении микрочиповыханалитическихсистем,которыеобладаютпринципиальноновымипреимуществами [27, 35]. К числу таких преимуществ относятся: высокоебыстродействие, высокие скорости нагрева и охлаждения реакционной смеси,низкоепотреблениедорогостоящихПЦР-реактивов,проведениеПЦРв«цифровом формате» [36, 37], а также потенциальная возможность интеграциинескольких стадий молекулярно-генетического анализа в едином микрочипе.Однаизпервыхмикрочиповыханалитическихсистемсвысокимбыстродействием ПЦР анализа продемонстрирована в 1993 группой Нортрупа сиспользованием микрочипа, выполненного из кремния [38].Благодаря низкой термической массе микрочипов и проб микрочиповыеаналитические системы позволяют достичь максимальных скоростей нагрева 175°С/с и охлаждения 125 °С/с и выполнить 40 циклов ПЦР менее чем за 6 минут[39].
При этом становится возможным сократить расход реактивов до 0.01–1 мклна реакцию и увеличить производительность до нескольких тысяч одновременнорегистрируемых реакций [40].~ 20 ~I.2.1. Особенности использования микрочиповых технологий для проведенияОТПЦРВнедрение микрочиповых технологий в метод ОТПЦР несколько отличаетсяот подходов к классической ПЦР ввиду дополнительной стадии обратнойтранскрипции.
Так, во многих работах по ОТПЦР в микрофлюидное устройствовключены только две стадии процесса – выделение РНК и синтез кДНК. Авторытаких подходов исходили из того, что молекула РНК в гораздо большей степениподвержена деструкции и мешающему влиянию посторонних веществ, таких какРНК-аза и др., которые содержатся в воздухе, поэтому с точки зрения точности инадежности анализа стадия синтеза кДНК из РНК должна проходить вавтоматическом режиме в закрытой системе.
Так, в работе [41] представленмикрочип для ОТПЦР, который обладает очень высокой чувствительностью ивключает в себя экспрессную (1 мин) стадию экстракции РНК из лизата спомощью продольного магнитофореза с использованием магнитных сферическихчастиц, на поверхности которых иммобилизированы олиго-dT фрагменты. Внутриканалов данного микрочипа под определенным углом к приложенному внешнемумагнитному полю внедрен массив ферромагнитных волокон. С помощью боковыхсмещений результирующего вектора магнитной и гидродинамический силосуществлялся точный контроль потоков внутри каналов.Несмотря на сложность объединения всех стадий ОТПЦР в одну платформу,предпринято несколько удачных попыток создать полностью интегрированныйчип.
В работе [42] предложена схема интегрированного микрофлюидногоустройства, которое выполняло очистку нуклеиновых кислот, амплификацию идетектирование методом электрофореза. В работе [43] также удалось совместитьвсе стадии ОТПЦР, в котором пробоподготовка осуществлялась за счетселективногосвязываниясуперпарамагнитныхиконцентрированияэпоксидныхшариковвирусовDynabeads®наповерхностиM-450,покрытыхспецифичными антителами. С помощью интегрированных микронасосов и~ 21 ~микроклапановвесьпроцессвыполнялсяавтоматически,необходимостьвмешательства оператора сводилась к минимуму.Автоматические микрочиповые приборы для проведения ПЦР и ОТПЦР ужепокинули исследовательские лаборатории и все шире используются дляисследований в рутинной диагностической практике молекулярно-генетическогоанализа [44, 45, 46]. В работе [47] проведена валидация коммерческоймикрочиповой системы VereFluTM для быстрого обнаружения птичьего гриппаH1N1, а также его типирования (установления штамма вируса).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
