Диссертация (1150270), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Такое взаимодействие в основном обеспечивается на неровнойповерхности, например пористой. Монодисперсные сферические частицы (восновном частицы одинаковых размеров) имеют преимущество относительнополидисперсных,таккакобеспечиваютвоспроизводимостьмагнитногоразделения.В зависимости от дальнейшей обработки образцов, не всегда можнооставлять НК на сорбенте. Прямое ПЦР определение ДНК/РНК не можетпроводиться без элюирования нуклеиновых кислот с поверхности сорбента, таккак реакция будет ингибироваться магнитными частицами, их стабилизаторамиили оксидами металлов [137].
Элюирование НК с поверхности магнитных частицможет быть достигнуто путём увеличения ионной силы, температуры или pH.Магнитные частицы также эффективно удаляют многие ингибиторы ПЦР[138, 139, 140]. Достаточно направить магнит в сторону сосуда, который содержитраствор образца, для скапливания частиц у стенки сосуда и отделитьнадосадочную жидкость (рис. 19).Рис. 19. Схематическая иллюстрация очистки нуклеиновых кислот с помощью магнитныхсорбентов.~ 50 ~Основные сведения о болезни Ньюкасла и Инфекционном бронхите курI.6.Болезнь Ньюкасла (лат. Pseudopestis avium, Morbus Newcastle,), псевдочумаптиц или азиатская чума птиц – это высококонтагиозное вирусное заболеваниептиц, характеризующееся поражением респираторных и висцеральных органов,центральной нервной системы и сопровождающееся гибелью и падениемпродуктивности [141].Возбудителем данной болезни является РНК содержащий вирус (НБ) изсемейства парамиксовирусов ( Paramyxoviridae род Paramyxovirus) размером120—180нм.Всоставвируснойчастицывходятрибонуклеопротеид,гемагглютинин (v-антиген), ферменты (нейроминидаза, полимераза), гемолизин,липиды и углеводы.
Вирус обладает способностью репродукции на культуретканей, цитопатогенным действием, гемоагглютинирующей активностью кэритроцитам кур [142].БолезньНьюкаслаявляетсяэндемическойвомногихстранах.Инкубационный период короткий — до 4-х дней. Молодняк болеет чаще всего ватипичной форме с невыраженной клинической картиной.
Продуктивность у курнесушек снижается до 50%, яйца с тонкой скорлупой или без неё ("литье яиц").Клинические признаки болезни разнообразны в зависимости от степенизаражения, возраста птиц, условий содержания и др. Течение болезни может бытьмолниеносным, острым (велогенная форма), подострым (мезогенная форма) ихроническим (лентогенная форма). При молниеносном течении заболевшая птицапогибает внезапно без выраженных клинических признаков. При остром теченииаппетит у птиц резко ухудшается, а затем пропадает.
У большинства заболевшихптиц температура тела повышается до 44 °С. Смерть наступает через 3–12 днейпосленачалаболезниприсильномистощении[143].Эффективныхлекарственных препаратов для лечения псевдочумы нет. В промышленныхптицеводческих хозяйствах вся больная птица подлежит уничтожению ввиду~ 51 ~угрозыразносаинфекции.Использованиепрофилактическихвакцинисанитарных мероприятий снижает вероятность вспышек. Контакт людей синфицированнымиптицамиможетвызватьлёгкийконъюнктивитигриппоподобные симптомы, но вирус НБ не представляет никакой опасности дляздоровья человека [144].Инфекционныйбронхиткур(InfectiousИБК)bronchitis,—высококонтагиозная болезнь, характеризующаяся поражением органов дыхания умолодняка, поражением репродуктивных органов и потерей продуктивности увзрослых кур–несушек, а также нефрозонефритным синдромом [145].Возбудителем данной болезниCoronavirusaviaизродаявляется также РНК-содержащий вирусCoronavirus,семействоCoronaviridaeмиксовирусов).
Размер вириона составляет 65–135 нм.(группаВирион круглой илиэллиптической формы с шероховатой поверхностью и отходящими от нееотростками длиной до 20 нм, которые образуют бахрому, или «солнечнуюкорону». Свободные концы отростков часто утолщены.
Вирусные частицы могутрасполагаться группами или цепочками. У некоторых вирусных частиц ясновидна мембрана [146]. В настоящее время в литературе описано около 30разновидностей серотипов вируса инфекционного бронхита кур. Антибиотики ихимиопрепараты(нитрофураны,сульфаниламиды,идр.)неоказываютгубительного действия на вирус. Вирус инфекционного бронхита, попав ворганизм тем или иным путем, очень быстро проникает в восприимчивые клетки,главным образом в эпителий дыхательного аппарата. В организме птиц вирусинфекционного бронхита быстро размножается в клетках респираторных органов,и уже через 12 ч после заражения в покровном эпителии трахеи обнаруживаютзрелые вирусные частицы.
Вирус ИБК не агглютинирует эритроциты кур имлекопитающих [147]. К заболеванию в основном восприимчивы цыплята ввозрасте до 30 дней, а так же куры в возрасте 5–6 месяцев. До 20−40% цыплят,переболевших инфекционным бронхитом, подлежат выбраковке вследствиенедоразвития.~ 52 ~Особенностью болезни является то, что спустя 3−5дней после ее появленияона быстро поражает всех птиц в стаде. Вначале заболевают цыплята, а затемболезнь переходит на молодых и взрослых кур.
Следует иметь в виду, чтодиагностировать инфекционный бронхит довольно трудно, так как большинствоболезней органов дыхания у птиц протекает со сходной клинической картиной.Если ИБК циркулирует в хозяйстве впервые, то летальность доходит до 70%.I.6.1. Классические методы определения вирусов Ньюкасла иинфекционного бронхита курДля того чтобы определить вирусы по методам пассажей, первой стадии упогибших или вынужденно убитых цыплят делают соскобы со слизистыхоболочек.
Затем патологический материал суспендируют в мясопетонном бульоне(среда для культивирования микроорганизмов содержит экстрактивные веществаиз органов, 0.5% NaCl и 1% пептона). После осаждения крупных кусочков тканейнадосадочную жидкость используют для выделения вируса. Жидкость вводят валлантоисную полость куриных эмбрионов и в трахею 10-20 дневных цыплят.Для определения вируса НБ в лаборатории поступает мозг, трахея, печень иселезёнка умерших птиц. Из этих органов готовят суспензию, которой заражают30–60-дневных цыплят и 9–12 дневных эмбрионов.
В случае положительнойбиопробы цыплята заболевают псевдочумой спустя 3–5 дней, а эмбрионыпогибают через 48–72 часа. Для дополнительной проверки аллантоиснуюжидкость, отобранную упогибших эмбрионов исследуют по реакциигемагглютинации (РГА) и реакции задержки гемагглютинации (РТГА).Реакция гемагглютинации (рис. 20) основана на использовании эритроцитовсадсорбированнымиантителами,которыевзаимодействуютссоответствующими антигенами сыворотки крови больных птиц. При этомнаблюдается склеивание и выпадение эритроцитов на дно пробирки или ячейки ввиде осадка [148].~ 53 ~Рис. 20. Схематическое изображение реакции гемагглютинации.Реакция торможения гемагглютинации (рис. 21) основана на блокаде,подавлении вирусов антителами иммунной сыворотки, в результате чего вирустеряют свойство агглютинировать эритроциты.
РТГА применяют для диагностикимногих вирусных болезней, возбудители которых могут агглютинироватьэритроциты различных животных[150].Рис. 21. Схематическое изображение реакции торможения гемагглютинации.Основной недостаток РГА и РТГА заключается в том, что определениевирусовявляетсявизуальным,чтоможетпривестикнеправильномудиагностированию. Кроме того, процесс невозможно анализировать во времени идля проведения реакции требуется большой объём реагентов.Экспрессным, но довольно неточным методом является спектральноеопределение вирусов.
Известно, что спектр поглощения целых вирусных частицпредставляет собой комбинацию спектров белка и нуклеиновой кислоты. Длянуклеиновых кислот в области максимума (~260 нм) удельное поглощение (для0.1% раствора РНК А = 25, для 0.1% раствора ДНК А = 20) намного выше, чем~ 54 ~для белка (для 0.1% раствора белка А = 0.5). Спектр поглощения можноиспользовать для определения концентрации вируса.I.6.2. Иммуноферментный метод определения вирусов НБ и ИБКИммуноферментный метод (ИФА) основан на выявлении антигенов спомощью соответствующих им антител, конъюгированных с ферментом–меткой.После соединения антигена с ферментоиммуной сывороткой в смесь добавляютсубстрат и хромоген [148].
Субстрат расщепляется ферментом и его продуктыдеградации вызывают химическую модификацию хромогена, при этом цветахромогена меняется, причем интенсивность окраски прямо пропорциональнаколичеству связавшихся молекул антигена и антител.Наиболее распространённым подходом является твёрдофазный ИФА (ELISA)(рис. 22) В этом варианте иммунологического теста один из компонентовиммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе,например в лунках микропанелей из полистирола.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
