Диссертация (1150270), страница 12
Текст из файла (страница 12)
4:Таблица 4 Пропорциональные объемы реагентов для приготовления ОТПЦР смесиреагентов (Master mix)РеактивмклВода деионизированная9.0дНТФ5.0Праймеры (смесь прямых, обратных праймеров и зондов)2.410x ПЦР – буфер5.0Taq – полимераза0.6Ревертаза0.6Проба18.0С микрочипа удаляли защитную пленку, а затем помещали в картридж.
Вполость пластиковой рамки с помощью дозатора вносили 620 мкл минеральногомасла (ПМС-400) так, чтобы масло полностью закрывало поверхность микрочипа.Введение герметизирующей жидкости (ПМС-400) необходимо для минимизациириска контаминации и предотвращения испарения пробы. Приготовленный~ 75 ~раствордляпроведенияОТПЦР(ОТПЦР-смесь+проба)вводиливмикрореакторы под слой герметизирующей жидкости, как показано на рис. 28.Объем вводимого раствора в каждый микрореактор составлял 1.2 мкл.Рис. 282 Схема введения пробы в ячейки микрочипа.Далее картридж с микрочипом помещали в микрочиповый амплификаторнуклеиновых кислот AriaDNA и указывали температурные режимы с помощьюпрограммного обеспечения прибора в зависимости от анализируемого объекта.Терморежим для ОТПЦР: определение РНК вирусов ИБК и НБ: однократноеудержание при 37 °С — 1200 с; удержание при 94 °С — 180 с; термоциклирование(45 циклов): 5 с при 94 °С (денатурация), затем 20 с при 58 °С (отжиг праймеров иэлонгация).
Настройки детектора флуоресценции: FAM (для детектированиявируса Болезни Ньюкасла): выдержка 1000 мс; усиление 100 мс; ROX (длядетектирования вируса бронхита): выдержка 800 мс; усиление 100 мс. Послепроведения анализа картридж с микрочипом извлекали, затем аккуратноизвлекали микрочип из картриджа и помещали его в контейнер для утилизации.II.5.2. Проведение ОТПЦР c иммобилизированными реактивамиРеактивы: раствор пробы, ПЦР-буфер.Оборудование: ламинарный шкаф (ЗАО «Ламинарные системы», Россия),дозаторы переменного объема (0.1–3.0; 0.5–10; 10–100 мкл), центрифуга длямикропробирок с функцией встряхивания Vortex (Microspin-2400, BIOSAN),~ 76 ~амплификатор нуклеиновых кислот AriaDNA (Люмекс, Россия), дозаторыпеременного объема (0.5–10 мкл, 100–1000 мкл) и наконечники к ним,микропробирки на 1.5 мл, автодозатор переменного объема (0,5–10 мкл) инаконечники к нему,алюминиевые микрочипы с иммобилизированнымиреактивами.Проведениеанализа:РастворпробыиПЦР-буферасмешиваливсоотношении 9:1.
Например, для 30-луночного микрочипа брали 18 мкл пробы и 2мкл ПЦР-буфера. Далее повторяли все этапы для проведения ПЦР с жидкимиреактивами.II.6. Иммобилизация ОТПЦР-реактивов внутри микрореакторовалюминиевого микрочипа с помощью экспериментальной лиофильнойустановкиII.6.1. Экспериментальная установка для иммобилизации ОТПЦР-реактивовВ качестве рабочей камеры установки выбран вакуумный эксикатор объемом4 л, позволяющий разместить хладагент и шестнадцать микрочипов вметаллическихпланшетах(рис.29).Стеклянныекерамическая подставка обеспечивали достаточнуюстенкиэксикатораитеплоизоляцию, сохраняянизкую температуру хладагента.
Пониженное давление создавалось при помощиподсоединенного к эксикатору насоса, позволяющего напрямую работать смикрообъемами раствора, без использования конденсора.~ 77 ~Рис. 29. На керамической подставке (1) находится хладагент (2), на поверхность хладагентапомещены микрочипы (3), в т.
ч. и термочип (4), давление контролируется с помощьювакуумметра (5).Между эксикатором и насосом с помощью тройника к системе подключиливакуумметр Мерадат-ВИТ16Т1. Для контроля температуры использовалсятермодатчик,присоединенныйкалюминиевомумикрочипуспомощьютермоклея. Такое устройство позволяло контролировать температуру поверхностимикрочипа (рис. 30).Рис. 30. Устройство термочипа: термодатчик (1) присоединен к поверхности микрочипа (2) спомощью термоклея (3).~ 78 ~II.6.2. Методика приготовления растворов стабилизаторовРеактивы:дигидратD-(+)-трегалозы(Sigma-Aldrich,USA),поливинилпирролидон (ПВП) (Sigma-Aldrich, USA), Tween 20 (Fluka Analytical,USA), бычий сывороточный альбумин (БСА) (Thermo Scintific, 20 мг/мл),деионизированная вода.Оборудование: аналитические весы (WAX 60/220, RADWAG), маленькийшпатель, полипропиленовый флакон на 13 мл, центрифуга для микропробирок сфункцией встряхивателя Vortex (Microspin-2400, BIOSAN).Методика приготовления стандартного раствора стабилизаторов (№ 1):навески трегалозы (0.946 г) и ПВП (0.5г) смешивали в сухом полипропиленовомфлаконе на 13 мл, добавляли 0.25 мл Tween 20 и 4.75 мл деионизированной воды.Компоненты перемешивали до полного растворения трегалозы и ПВП.Непосредственно перед использованием раствор стабилизаторов разбавляли вдвоедеионизированной водой (при этом концентрации трегалозы, ПВП и Tween 20составляли соответственно 55.2, 7.6 и 4.4 ммоль/л).Таблица 5.
Состав растворов основных стабилизаторов (смесь № 1, №2 и №3)для лиофилизации ПЦР и ОТПЦР-реактивовКонцентрация в растворе стабилизаторов, ммоль/мл, №раствораКомпонент123Трегалоза55.2027.6013.80ПВП7.603.781.90Tween 204.402.201.10ПриготовлениерастворовБСА:дляприготовленияраствораБСА,концентрацией 2 мг/мл, брали 10 мкл 20 мг/мл раствора БСА и 90 мкл р-ра трисHCl, тщательно перемешивали на вортексе. Растворы БСА 0.2 и 0.02 мг/млготовили последовательным разбавлением исходного 2 мг/мл раствора.~ 79 ~II.6.3. Приготовление полной смеси ПЦР- и ОТПЦР-реактивов длялиофилизацииРеактивы: комплект реагентов для ОТПЦР в реальном времени (описанвыше в разделе), деионизированная вода (сопротивление 18МОм); растворыстабилизаторов в концентрациях, указанных в табл.
2, растворы БСА 2, 0.2, 0.02 и0.002 мг/мл (0.3, 0.03, 0.003, 0.0003 ммоль/л), раствор вакцины вируса ИБК,штамм H120 (для профилактики ИБК).Оборудование: ламинарный шкаф (ЗАО «Ламинарные системы», Россия),микропробирки на 1,5 мл, дозаторы переменного объема (0.1–3.0; 0.5–10; 10–100мкл) и наконечники к ним, центрифуга для микропробирок с функциейвстряхивания Vortex (Microspin-2400, BIOSAN).Приготовление смеси ОТПЦР реагентов для иммобилизации: смесь дляиммобилизации готовили непосредственно перед использованием и не хранили.Состав смеси объемом 31 мкл (рассчитано на 1 микрочип) приведен в табл. 6.Таблица 6. Составы лиофильных растворов для иммобилизации ОТПЦРреактивов, а также плазмид и вакцин в микрореакторах алюминиевых микрочиповНомер смеси,компонент, мклРастворстабилизаторовДНТФ, 2,5 мМTaq ПолимеразаРевертазаРаствор праймеровВодадеионизированнаяРаствор БСАРаствор вакциныРаствор плазмиды123457.507.507.507.507.503.750.750.753.603.750.75–3.6014.5515.303.750.750.753.60–3.750.750.753.60–3.750.750.753.60–––––––14.55––14.5518.00–14.55–18.00II.6.4.
Методика иммобилизации реактивов внутри ячеек алюминиевогомикрочипаРеактивы: приготовленные для лиофилизации смеси.~ 80 ~Оборудование: вакуумный эксикатор, насос, морозильная камера (T = –18°C), штативы для микрочипов, вакуумметр Мерадат-ВИТ16Т1, автодозаторпеременного объема (0.5–10 мкл) и наконечники к нему, алюминиевыемикрочипы.Методика лиофилизацииЛиофильную смесь раскапывали в ячейки микрочипов с помощьюодноканального электронного дозатора в режиме многократного дозирования.Объем вводимой в ячейку смеси составлял 1 мкл для 30-луночных чипов.
Готовыемикрочипы размещали на штативах, предварительно выдержанных в морозильнойкамере при температуре –18 °С, для замораживания лиофильной смеси. Далеештативы с чипами помещали в вакуумный эксикатор, в котором с помощьюнасоса создавалось пониженное давление. Вакуумный эксикатор непосредственноперед использованием снабжался металлическими аккумуляторами холода вколичестве 2 – 3 шт., предварительно выдержанными при температуре –18 °С.При давлении на уровне 100 Па и низкой температуре высушивали чипы втечение 120 минут. После завершения лиофилизации для защиты микрочипа отпопадания загрязнений, рабочую поверхность микрочипа заклеивали защитнойполимерной пленкой.II.6.5. Методика искусственного старения микрочипов симмобилизированными реагентамиОборудование: термостат длямикропробирок от 25 до 100 °С (ДНК-технология), микрочипы с иммобилизированными реагентами.Проведениеискусственногостарения:определениесрокагодностимикрочипов методом искусственного старения подразумевает выдерживаниемикрочипов на поверхности термостата при заданной температуре в течениеопределенного интервала времени.
Для опытовиспользовали термостат,автоматически поддерживающий заданную температуру экспериментального~ 81 ~хранения tэ в течение всего опыта с точностью ± 0,5 °С. Выбранная температурадля ускоренного старения составила 35 °С, длительность эксперимента – 6 дней.II.7. Исследование морфологической структуры лиофильных пленокметодом сканирующей электронной микроскопииДляисследованияморфологическойструктурыиммобилизированныхреагентов с помощью микроскопии лиофильную смесь лиофилизировали наспециальной подложке в виде медной сетки для микроскопии.
В работеиспользовался сканирующий электронный микроскоп Zeiss Merlin (Научный ПаркСПбГУ)сполевымэмиссионным катодом,колоннойэлектроннойоптикой GEMINI-II и безмаслянной вакуумной системой. Помимо детектороввторичных электронов In-lens SE и SE2, микроскоп оснащен дополнительнойприставкой для рентгеновского микроанализа Oxford Instruments INCAx-act.Ускоряющее напряжение составило 15 кВ.Рис. 31 Медная подложка для исследования лиофильных пленок методомсканирующей электронной микроскопии.~ 82 ~III.Результаты плазмохимического осаждения пленок на поверхностиалюминиевых микрочиповДля создания на поверхности алюминиевых микрочипов покрытий,обеспечивающих условия, близкие к проведению ПЦР в классических инертныхполипропиленовых пробирках, в данной работе выбраны два основных мономера:ГМДС, который способен обеспечить адгезию покрытия к алюминию за счетковалентных полярных связей Si–O и ацетилен, обладающий высокимискоростями его полимеризации в плазме [149].Большинство современных теорий о механизме Plasma Enhanced ChemicalVapor Deposition (PECVD) описывают в качестве интермедиата в реакциях ПХОименно ацетилен, поэтому можно предположить, что основные пути реакций, иструктурапокрытияпредставлялитрехмернуюполимернуюсеткусполистирольными фрагментами, описанную в работе [150].Рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
