Диссертация (1150270), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Надосадочную жидкость, которая содержит очищенные РНК,аккуратно отделяют от осадка.II.4.2. Выделение РНК из биологического материала с помощью комплектареагентов "АмплиПрайм РИБО-сорб"Реактивы: пассажи вируса инфекционного бронхита или болезни Ньюкасла,комплектреагентовдляэкстракцииРНКизклиническогоматериала«АмплиПрайм РИБО-сорб» (ИнтерЛабСервис): лизирующий раствор, раствор дляотмывки 1, раствор для отмывки 3, раствор для отмывки 4, сорбент (суспензиябелого цвета), РНК-буфер.Оборудование: Ламинарный бокс (ЗАО «Ламинарные системы», Россия),термостат для пробирок типа"Эппендорф" от 25 до 100 °С (Термит, ДНК-технологии, Россия), вакуумный отсасыватель медицинский с колбой–ловушкойдля удаления надосадочной жидкости (ОМ-1, Утес, Россия), микроцентрифуга дляпробирок типа "Эппендорф" до 16000 об/мин (centrifuge 5415D, eppendorf,Германия), центрифуга для микропробирок с функцией встряхивателя Vortex(Microspin-2400, BIOSAN), набор механических дозаторов переменного объёма,одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиеся пробирки на 1.5 мл,~ 69 ~штативы для наконечников, одноразовые наконечники для дозаторов переменногообъёма с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл, ёмкость для сброса наконечников.Методика выделения РНК из исследуемых образцовВ начале работы лизирующий раствор и раствор для отмывки 1 (если онихранились при температуре от 2 до 8 °С) прогревают при температуре от 60 до 65°С до полного растворения кристаллов.
В каждую пробирку вносят по 450 мкллизирующего раствора и 100 мкл пробы, используя наконечники с фильтром.Далее плотно закрытые пробы тщательно перемешивают на вортексе ицентрифугируют в течение 5 с при 5000 об/мин на ультрамикроцентрифуге дляудаления капель с внутренней поверхности крышки пробирки. Перед началомработы с сорбентом его тщательно ресуспендируют на вортексе. В каждуюпробиркуслизатомотдельнымнаконечникомдобавляютпо25мклресуспендированного сорбента, перемешивают на вортексе и оставляют на 5 минв штативе.
После прохождения сорбции пробирки центрифугируют при 10000об/мин в течение 30 с на ультрамикроцентрифуге, а надосадочную жидкостьудаляют, используя вакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждойпробы. Далее приступают к стадии очистки адсорбированной РНК. Для очисткиот ингибиторов гидрофильной природы в пробирки добавляют по 400 мклрастворадляотмывки1,перемешиваютнавортекседополногоресуспендирования сорбента, центрифугировали 30 с при 10000 об/мин наультрамикроцентрифугеиудаляютнадосадочнуюжидкость,используявакуумный отсасыватель и отдельный наконечник для каждой пробы. Далее дляочистки от ингибиторов гидрофобной природы в пробирки добавляют по 500 мклраствора для отмывки 3, тщательно ресуспендируют сорбент на вортексе, а потомцентрифугируют30спри10000об/миннаультрамикроцентрифуге.Надосадочную жидкость удаляют, используя вакуумный отсасыватель иотдельный наконечник для каждой пробы.
Отмывку раствором 3 повторяют ещераз. На последней стадии очистки в пробирки добавляют по 400 мкл раствора дляотмывки4,сноватщательноресуспендируютсорбентнавортексе,~ 70 ~центрифугируют 30 с при 10000 об/мин на ультрамикроцентрифуге. После этогонадосадочную жидкость полностью удаляют из каждой пробирки отдельнымнаконечником, используя вакуумный отсасыватель, пробирки помещают втермостат при температуре 60 °С на 12–15 мин для подсушивания сорбента, приэтом крышки открыты.
После высушивания в пробирки добавляют по 50 мклРНК-буфера, используя наконечник с фильтром, перемешивают на вортексе ипомещают в термостат при температуре 60 °С на 2–3 минуты После этогопробирки еще раз перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12–13 тыс.об/мин в течение 1 мин на ультрамикроцентрифуге. Полученная надосадочнаяжидкость содержит очищенные от ингибиторов РНК.II.4.3. Выделение РНК из биологического материала с помощью магнитныхчастицОборудование: Ламинарный бокс (ЗАО «Ламинарные системы», Россия),термостат для пробирок типа"Эппендорф" от 25 до 100 °С (Термит, ДНК-технологии, Россия), вакуумный отсасыватель медицинский с колбой–ловушкойдля удаления надосадочной жидкости (ОМ-1, Утёс, Россия), магнитный штатив надвенадцать пробирок на 1.5 мл, центрифуга для микропробирок с функциейвстряхивателя Vortex (Microspin-2400, BIOSAN), набор механических дозаторовпеременного объёма, одноразовые полипропиленовые плотно закрывающиесяпробирки на 1.5 мл, штативы для наконечников, одноразовые наконечники длядозаторов переменного объёма с фильтром до 200 мкл и до 1000 мкл, ёмкость длясброса наконечников.Приготовление растворов для выделения РНК с помощью магнитныхчастиц1) Приготовление раствора для лизиса:Оборудование:аналитическиевесы(ОКБВЕСТА,переменного объёма (200–1000 мкл) и наконечник к нему.Россия),дозатор~ 71 ~Реактивы: гуанидин тиоционат (helicon, Россия), поливинилпирролидон(SIGMA-ALDRICH, Россия), тритон Х-100, этилендиаминтетрауксусная кислота(helicon, Россия), ацетат аммония (НеваРеактив, Россия).В одноразовую баночку на 30 мл добавляли реактивы в количестве,приведенном в табл.
3.Таблица 3: Реактивы для приготовления раствора для лизисаРеактивФормуламасса/объёмгуанидин тиоционат14.180 гполивинилпирролидон0.606 гТритон Х-100этилендиаминтетрауксусная кислотаацетат аммонияОбъём раствора доводили до 30 мл дистиллированной водой.0.60 мл0.220 г0.120 г~ 72 ~Приготовление раствора для отмывки 1: в одноразовую баночку на 30 млналивают 21 мл этилового спирта и 9 мл дистиллированной воды.Приготовление раствора для отмывки 2: в одноразовую баночку на 30 млналивали 30 мл ацетона.Методика выделения РНК с помощью магнитных частицВ каждую пробирку на 1.5 мл добавляли по 1 мл раствора для лизиса ивносили по 100 мкл подготовленных проб, используя отдельные наконечники сфильтром для каждой пробы.
Содержимое пробирок тщательно перемешивали навортексе и центрифугировали на вортексе в течение 5–10 с для удаления капель свнутренней поверхности крышки, а потом прогревали 5 мин при 80 °С втермостате. Магнитные частицы тщательно ресуспендировали на вортексе, вчистые одноразовые пробирки на 1.5 мл добавляли по 8 мкл магнитных частиц ипереносили лизат, не захватывая осадок. Пробирки тщательно перемешивали навортексе и помещали в магнитный штатив до полного осветления раствора. Далее,не вынимая пробирки из магнитного штатива, аккуратно, не задевая магнитныечастицы, удаляли надосадочную жидкость, используя вакуумный отсасыватель иотдельный наконечник для каждой пробы.
После этого приступали к очисткемагнитных частиц. Для этого в каждую пробирку добавляли по 1 мл раствора дляотмывки 1 (70% этиловый спирт), тщательно перемешивали на вортексе и сновапомещали в магнитный штатив до полного осветления раствора с последующимотсасыванием жидкости. Для очистки от гидрофобных примесей в каждуюпробирку добавляли по 1 мл растворадля отмывки 2 (ацетон), и повторялиоперацию с удалением жидкости в магнитном штативе. После пробирки соткрытыми крышками оставляли в магнитном штативе, до полного высыханиямагнитных частиц. Далее в каждую пробирку добавляли по 50 мкл раствора дляэлюирования, аккуратно наконечником переносили магнитные частицы в раствор.Для ускорения десорбции пробы прогревали при 80 °С в течение 10 мин,периодически встряхивая их на вортексе.
Затем пробирки помещали в магнитный~ 73 ~штатив и после полного осветления раствора аккуратно, не задевая осадок,переносили готовые пробы РНК в чистые пробирки.Контроль чистоты выделенной РНК осуществляли с помощью измеренияотношения оптических плотностей при 260 нм к 280 нм. Измерения проводили наоднолучевом спектрофотометре со ксеноновой лампой (SmartSpec Plus, Bio-Rad,Россия) в пластиковых полистироловых кюветах на 3.5 мл.II.5. Проведение ОТПЦР с помощью микрочипового анализатора AriaDNAII.5.1. Проведение ОТПЦР на жидких реактивахРеактивы: комплект реагентов для ОТПЦР в реальном времени: растворДНТФ (Helicon, 100 мМ/мл), раствор прямых и обратных праймеров (DNASynthesis, Reverse – 5`–CTACCGCTAGATGAACCAGAG–3`, 3.5 OE; Forward –5`–GCTGGTATCACTGCTTGTTTG–3`,3.5OE),растворзонда(ROX–CCGTTGCTTGGGCTACCTAGTATCC–BHQ–2, краситель карбокси-Х-родамин(ROX), λвозб = 580 нм, λисп – 605 нм, тушитель BHQ-2 – Вlack Hole Quencher-2,λmaxabs = 579 нм, рабочий диапазон гашения 560–670 нм, c = 2.5 OE) – длядетектирования РНК вируса инфекционного бронхита кур, раствор прямых иобратныхпраймеров(DNA-Synthesis,GGATGACATTGTGGCAGAAGG–3`,ACCAAACFGAGAATCGGTGAG–3`,ReverseForward3.5OE,раствор5`–5`–зондаFAM–ACGGGTAGAAGGTGTGAACCTCGA – BHQ–1, краситель карбоксифлуоресцеин(FAM), λвозб = 495 нм, λисп – 520 нм, тушитель BHQ–1 – Вlack Hole Quencher–1,λmaxabs = 534 нм, рабочий диапазон гашения 480–580 нм, c = 2.5 OE; — длядетектирования РНК вируса Болезни Ньюкасла; 10×ПЦР буфер, Taq ДНКполимераза (Evrogen, 5E/мкл), ревертаза (AMPLISENS), растворы проб вирусовИБК и Болезни Ньюкасла, деионизированная вода (сопротивление 18МОм),полиметилсилоксан-400 («Пента-Север», Россия).~ 74 ~Оборудование: ламинарный шкаф (ЗАО «Ламинарные системы», Россия),дозаторы переменного объема (0.1–3.0; 0.5–10; 10–100 мкл), центрифуга длямикропробирок с функцией встряхивания Vortex (Microspin-2400, BIOSAN),амплификатор нуклеиновых кислот AriaDNA (Люмекс, Россия),дозаторыпеременного объема (0.5–10 мкл, 100–1000 мкл) и наконечники к ним,микропробирки на 1.5 мл, автодозатор переменного объема (0.5–10 мкл) инаконечники к нему, алюминиевые микрочипы.Проведение анализаВсереактивымикроцентрифуги.сначалаДляразмораживалипроведенияодногоивстряхивалианализа(приспомощьюиспользованиимикрочипа на 30 ячеек) реактивы смешивали в пропорциях, указанных в табл.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
