Диссертация (1150270), страница 7
Текст из файла (страница 7)
Yoshioka с соавт., к примеру, обнаружилвклад обоих факторов: как кинетического, так и термодинамического [96].I.4.3. Основные стабилизаторы для ПЦР компонентовКак отмечалось выше, своеобразными криопротекторами для стабилизациибиологически активных молекул чаще всего выступают сахариды [97], особенноневосстанавливающиедисахариды,атакжеводорастворимыеполимеры,имеющие электроположительные или электроотрицательные группы, способные кобразованию водородных связей с ферментами.
В случае со стабилизациейполимеразы и ревертазы особенное внимание исследователей привлекаеттрегалоза и поливинилпирролидон (ПВП) [98]. В табл. 1 представлены основныестабилизаторы, а также их главные функции. Так, ПВП является динамическимпассиваторомипроявляетстабилизирующеедействиепосредствомнеспецифических взаимодействий между ферментом и полимером в ходединамического растворения. Таким образом, ПВП отделяет фермент отокружающей среды, в том числе от поверхности алюминия, препятствуя, такимобразом, ее отрицательному воздействию.Добавление сахаридов в лиофильную систему позволяет защитить ферментыот потери активности [99], химической [100] и тепловой денатурации [101, 102].Отметим, что присутствие сахаридов (в т.ч.
дисахаридов) ингибирует агрегациюбелков и ускоряет восстановление их активности после регидратации [103].~ 43 ~Таблица 1. Основные компоненты раствора стабилизаторовСтабилизаторФормулаОсновнаяФункциядинамическийпассиваторПВПТрегалозазащитафункцианальныхгруппTween-20ДиспергаторОдним из самых распространенных дисахаридов, который используют вкачестве стабилизатора является трегалоза — невосстанавливающий дисахарид, вкотором две единицы глюкозы связаны α,α-1,1-гликозидной связью. В работах[104,102] показано, что трегалоза может защитить белки и клеточные мембраныот денатурации, вызванной различными стрессовыми состояниями, в том числевысыханием, обезвоживанием, повышенными или пониженными температурамииокислением.Трегалозаобладаетнаилучшейэффективностьюсредидисахаридов, так как защищает функциональные группы и сохраняет третичнуюструктуру белка в процессе сушки через образование водородных связей [105].Кроме того, защитные свойства трегалозы при лиофилизации можно объяснить еевысокой температурой стеклования ( чем выше Tg, тем выше стабильностьвысушенной матрицы при возрастании температуры) [106].
В частности,безводная трегалоза имеет Tg = 110 °C, сохраняя высокую вязкость при высокихтемпературах [107].В последнее время в качестве стабилизатора стали использовать бычийсывороточный альбумин (БСА) — белок плазмы крови крупного рогатого скота,~ 44 ~молекулы которого состоят из одинарной аминокислотной цепочки, содержащей582 аминокислотных остатка. Основная функция данного стабилизаторазаключается в стабилизации определенных ферментов и предотвращения ихадгезии к стенкам сосудов в результате конкурентной сорбции [108], а также дляоблегчения растворения белков при их регидратации.Кроме вышеперечисленных стабилизаторов в качестве дополнительныхкомпонентов в лиофильных смесях часто используют поверхностно-активныевещества (ПАВ) благодаря их способности к образованию мицелл с гидрофобнойчастью внутри мицеллы и гидрофильными группами в наружной (рис.
17) [109].Среди многих разновидностей ПАВ большой интерес с точки зрениястабилизации лиофильных смесей привлекают неионогенные ПАВ, которыеотличаются от ионных тем, что их головная группа не заряжена и гидрофильна.Такие вещества считаются мягкими поверхностно-активными веществами, таккак они разрушают белково-липидные и межлипидные, но не межбелковыевзаимодействия и большинство из них не вызывает денатурации белков. Такимобразом, белки могут быть растворены в своей естественной и биологическиактивной форме с сохранением белковых взаимодействий [110].Рис.17 А — Схематическое изображение ПАВ и В — мицелла, образованная ПАВ и белком.Так, в работах [111, 112], посвященных ПЦР широко используют Tween-20,который относится к полисорбатным ПАВ, состоящим из эфира жирной кислотыи длинной полиоксиэтиленовой цепи.
В основном, этот неионогенный ПАВ~ 45 ~используетсявкачествесмачивателя,диспергатораисолюбилизатора(растворителя) белков.I.4.4. Особенности применения метода лиофилизации для ПЦР реактивовЛиофилизация ПЦР-реагентов позволяет избежать сложностей, связанных сих хранением. Кроме того, помимо сушки отдельных компонентов [113]возможно совместное хранение всех ПЦР реактивов, за исключением буферногораствора [114], что упрощает процесс ввода проб и уменьшает рискложноположительных результатов, которые могут быть вызваны внесениемчужеродной ДНК при смешивании и вводе реагентов [115].Первые работы по лиофилизации ПЦР-смеси направлены на высушивание вмикропробирках.
Так, в работе [116] лиофильно высушивали 20 мкл ПЦР-смеси.Подобный подход позволил упростить процедуру смешивания и ввода реактивови проб, но не решал в полной мере проблему большого расхода ПЦР реактивов.Актуальной задачей является иммобилизация ПЦР-реактивов в микрочипах,что позволило бы совместить преимущества этих подходов. В работе [117]вмикрореакторах иммобилизировали только праймеры. В работе [114] показанапринципиальная возможность иммобилизации ПЦР-реактивов на поверхностикремниевых микрочипов, но предложенный способ позволял проводить процесстолько для одного чипа.
В связи с преимуществами, которыми обладаетпроведение ПЦР с использованием иммобилизованных реактивов, актуальнойпредставляетсязадачаналадитьмассовоепроизводствомикрочиповсиммобилизованными реактивами. Создание массового производства ставитвопрос о замене материала для изготовления микрочипа с кремния на болеетехнологичный алюминий, ранее уже показавший свою пригодность дляпроведения ПЦР на жидких реактивах.~ 46 ~I.5.Методы выделения нуклеиновых кислотПеред анализом ОТПЦР, необходимо провести пробоподготовку и выделитьРНК из исследуемого объекта. Стоит отметить, что одним из недостатков илимитирующих факторов применения метода ПЦР является зависимостьрезультатов от чистоты пробы. Наличие ингибиторов может привести к тому, чтоположительная проба не будет работать, поэтому пробоподготовке РНК споследующимПЦРопределениемуделяетсяоченьбольшоевниманиеисследователей.Существует множество методов пробоподготовки биологических образцов,которые, как правило, многостадийны и сложны в исполнении.
Полнотавыделения НК из пробы, а также отсутствие в выделенной пробе ингибиторов идругих загрязняющих веществ обеспечивают успех определения НК. Выборосновных условий и параметров пробоподготовки зависит от вида образца(грибы, человеческие клетки, грамположительные или грамотрицательныебактерии и т.д.), а также физико-химических особенностей матрицы пробы(отдельно взятые ткани, кровь, почва, растение и др.).
Несмотря на многообразиевариантов, весь цикл пробоподготовки можно разделить на четыре основныестадии: лизис (применение хаоторопного вещества и белково-разрушающихферментов), сорбция, очистка и элюирование НК.I.5.1. Классические методы выделения нуклеиновых кислотМетод выделения нуклеиновых кислот из жидкой фазы основан на сложныхстадиях преципитации и очищения. Основной принцип преципитации РНК (рис.18) заключается в формировании и осаждении комплекса растворимогомолекулярного антигена со специфическим антителом.
Осадок комплексаантиген–антитело называется преципитатом.~ 47 ~Рис. 18. Схематическое изображение реакции преципитации.Данные методы не только громоздки, но и трудоемкие, а это в свою очередьувеличивает риск разрушения РНК и кросс-контаминации образцов.Сорбционные методы выделения нуклеиновых кислот основаны на такихвзаимодействиях, как: образование водородных связей между раствором исорбентом; ионные взаимодействия (анионный обмен); сродство размеров.Основой твёрдой фазы, которая сорбирует НК, являются частицы SiO2 [118, 119],а также стекловолокно или анионно-обменные носители [120], которыеиспользуются в хроматографических разделительных колонках.
Связь НК–сорбентобразуетсявприсутствиивысококонцентрированныхрастворовхаотропных солей (например: иодата натрия, перхлората натрия, гуанидинтиоционата).I.5.2. Выделение нуклеиновых кислот с помощью магнитных частицИспользованиемагнитныхтвёрдыхносителейвбиохимическихимолекулярно-биологических процессах имеет ряд преимуществ по сравнению сдругими немагнитными методами выделения НК.
Основной принцип заключаетсяв том, что частицы, обладающие магнитным моментом, могут быть извлечены израствора при наложении магнитного поля, например при использованиипостоянного магнита. Данный метод является быстрым, простым и эффективным~ 48 ~для разделения частиц после связывания с НК или на стадии элюирования. Такимже образом можно изолировать компоненты разрушенных клеток, которыеингибируют ДНК-полимеразу в ПЦР. Основными ингибиторами ПЦР являютсяионы кальция, полисахариды, фенольные соединения, гумусовые вещества, белки(коллаген,гемоглобин,иммуноглобулин)[121,122].Ингибиторымогутнаходиться в биологическом материале, а могут быть добавлены в процессеобработки образца или выделения нуклеиновой кислоты. Такими веществамимогут быть порошок из перчаток [123], различные соли (например, хлоридынатрияикалия),атакжеорганическиемолекулы(например,этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), этанол, изопропиловый спирт илифенол) [124, 125, 126, 127].
С одной стороны некоторые из этих веществнеобходимы для успешного лизиса клеток, а с другой являются ингибиторами[128].Материалы для изготовления магнитных частиц различны: синтетическиеполимеры, пористое стекло или магнитные частицы из неорганическихмагнитныхматериалов,напримерповерхностно-модифицированныйоксиджелеза. Особенно популярными являются суперпарамагнитные частицы, которыене взаимодействуют между собой в отсутствии магнитного поля. Данные частицыбудут магнититься только в магнитном поле, а после удаления из него будуттерять магнетизм.Обычно поверхность коллоидных частиц магнетита Fe3O4 в лабораторииобрабатывают оксидом кремния (ІІ).
Оксид железа способен адсорбировать ДНК[129], но у агрегатов из-за силы притяжения уменьшается площадь поверхности,используемая для адсорбции [130]. В работах [131, 132] использовали интересныемагнитные частицы, которые предварительно модифицировали бактериями вприсутствии амино-силикатов и сверхразветвленных полиамидаминов. В целяхпробоподготовкидляПЦРчащевсегоиспользуютповерхностномодифицированные магнитные наночастицы с алкоксисиланами [133, 134] илиполиетилениминами [135, 136].~ 49 ~Процесс связывания НК с сорбентом может быть описан, как обёртываниенуклеиновых кислот вокруг частицы с помощью ионных и ванн-дер-ваальсовыхвзаимодействий.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
