Диссертация (1150270), страница 9
Текст из файла (страница 9)
При определении антител влунки с сорбированным антигеном последовательно добавляют сыворотку кровибольной птицы, антиглобулиновую сыворотку и смесь растворов субстрата дляфермента и хромогена. При положительном результате цвет хромогенаизменяется. Твердофазный носитель можно сенсибилизировать не толькоантигеном, но и антителами. Тогда в лунки с адсорбированными антителамивносят искомый антиген, добавляют иммунную сыворотку против антигена, азатем смесь растворов субстрата для фермента и хромогена [150].~ 55 ~Рис.
22. Схематическое изображение метода ELISA.Метод ИФА применяется для диагностики вирусных, бактериальных ипаразитарных болезней, содержащихся в исследуемом материале в минорныхконцентрациях — 10–10–10–12г/л. Преимуществами данного метода являетсяпростота и возможность проведения анализа большого объёма образцов.Существенным недостатком является сложность проведения количественногоанализа.Большинство ПЦР-методик для определения болезни Ньюкасла и куриногобронхита основаны на проведении ОТПЦР в пробирке с последующимэлектрофоретическим детектированием продуктов амплификации.
К сожалению,такой подход сильно снижает распространенность метода ПЦР в диагностическихветеринарных лабораториях. Многие птицефабрики имеют свои диагностическиецентры, однако сложность постановки ПЦР эксперимента требует особыхнавыков. С другой стороны, использование микрочипов с лиофилизированнымиреактивами в методе ОТПЦР с детектированием продуктов в режиме реальноговременизначительноупрощаетвысококвалифицированных операторов.процедуруПЦРинетребует~ 56 ~II.АППАРАТУРА, МЕТОДИКИ И ТЕХНИКА ЭКСПЕРИМЕНТОВII.1 Топология и устройство алюминиевого микрочипаВвиду высоких коэффициентов теплопроводности, в настоящей работеиспользовалисьалюминиевыемикрочипы,которыепредставляютсобойалюминиевую пластину с штампованными микрореакторами в виде обратнойусеченной пирамиды.На рис.
23 показана топология микрочипа, состоящего из алюминиевойпластины толщиной 0.7 мм и пластиковой рамки, которые соединялись междусобой с помощью герметика на основе силикона.Рис. 23. Топология алюминиевого микрочипа и габаритные размеры отдельногомикрореактора..Внутри пластиковой подложки, изготовленной из полиакрила, имелосьотверстие 17×17 мм, которое заполнялось минеральным маслом для герметизациипроб и предотвращения их испарения (рис. 24, а). Собранный таким образоммикрочип закреплялся в картридже (рис. 24, б), который в свою очередьвставляли в ПЦР-анализатор.Рис.
24. Изображения собранного алюминиевого микрочипа: а – микрочип до раскапыванияреактивов, б – микрочип, помещенный а картридж перед началом ПЦР-анализа.~ 57 ~II.2. Изготовление алюминиевого микрочипаСхема изготовления алюминиевых микрочипов состояла из несколькихэтапов:1) предварительной подготовки поверхности алюминиевой подложки;2) плазменной обработки алюминиевой подложки;3) локальной обработки отдельных участков микрочипа — гидрофилизации игидрофобизации поверхности алюминиевой подложки;4) соединения готовой алюминиевой подложки с пластмассовой рамкой.Стадия плазменной обработки поверхности будет детально рассмотрена вследующем подразделе.
Рассмотрим детально остальные стадии изготовлениямикрочипа.II.2.1. Оборудование для изготовления микрочиповМагнитнаямешалка,центрифуга(Sigma3-16P,Sartorius,Россия),безворсовые салфетки (Defender, Германия), ультразвуковая ванна ("Сапфир",Россия), вытяжной шкаф, дозатор (100–1000 мкл, Biohit) и наконечники к нему,силиконовый тампон, ПЦР-бокс с УФ (ЗАО «Ламинарные системы», Россия),пластиковые подложки для чипа (изготовлены по заказу), чашки Петри,стеклянные стаканы 200 мл, шприцы объема 1 и 10 мл.II.2.2. Реактивы для изготовления микрочиповПоливинилпирролидон (Aldrich Chemistry), фосфатно-солевой буфер (0.01 M,pH 7.3–7.5, Биолот, Россия), спирт изопропиловый, ТВИН-20 (Helicon),полидиметилсилоксан «Пента 107» (ООО «Пента Север», Россия), бутилацетат(х/ч, Экос-1), деионизованная вода, герметик силиконовый Loctite 5910, спиртэтиловый.~ 58 ~II.2.3.
Стадия 1: предварительная подготовка поверхности алюминиевойподложкиАлюминиевыеподложкипомещаливспециальныхфторопластовыхдержателях в смесь ацетона и этилового спирта в соотношении 1:1и облучалиультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 10 минут при комнатнойтемпературе. Далее картриджи вынимали из стакана и центрифугировали втечение 10 с при скорости вращения 1500 об/мин. Подложки вынимали изкатриджей и досушивали при температуре 50 °С в течение 2 минут.Таким образом, подложки обезжиривали и очищали от возможныхзагрязнителей.II.2.4.
Стадия 2: плазменная обработка алюминиевой подложкиДанная стадия изготовления микрочипа включает в себя несколько подходови несколько этапов и будет рассмотрена далее в разделе.II.2.5. Стадия 3а: гидрофилизация поверхности алюминиевой подложкиАлюминиевые пластины в специальных фторопластовых картриджахпомещали в пассивирующий раствор (стакан объемом 250 мл) состоящий изводно-изопропанольного раствора ТВИН-20, поливинилпироллидона и фосфатносолевого буфера и облучали ультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 10мин при комнатной температуре.
Далее картриджи центрифугировали дляудаленияизлишков пассивирующего раствора в течение 10 с при скоростивращения 1500 об/мин. После окончания центрифугирования алюминиевыепластины извлекали из картриджей, помещали в чашки Петри и досушивали 5–10мин на воздухе.~ 59 ~II.2.6. Стадия 3б: Гидрофобизация внешней (между микрореакторами)поверхности алюминиевой подложкиНа двойную безворсовую салфетку, помещенную в чашку Петри, выливали0.6 мл раствора П-107 в бутилацетате (1:3). Далее на внешнюю поверхностькаждой из пластин дважды наносили слой гидрофобного соединения методомтампонной печати (интервал между повторными нанесениями 1 мин).
Послегидрофобизации алюминиевые пластины помещали в чашку Петри и высушивали5–10 мин на воздухе.II.2.7. Стадия 4: соединение готовой алюминиевой подложки с пластмассовойрамкойПластиковые рамки предварительно очищали от загрязнений. Для этого ихпомещали в стакан объемом 250 мл, заливали этиловым спиртом и облучалиультразвуком в ультразвуковой ванне в течение 10 мин. Далее для нанесениясиликонового герметика подготавливали иглы шприцев. Для этого продажныеиглы 0.7 мм × 40 мм обрезали до длины 3–5 мм при помощи гравировальногоинструмента с наждачным кругом, торцевали и тщательно удаляли заусенцы снаружной и внутренней сторон иглы.
Инсулиновые шприцы объемом 1 млзаполняли герметиком в количестве 0.5–0.7 мл и только после заполнения нашприцы одевали подготовленные иглы. Далее на середину выступа тыльнойстороны пластиковой подложки выдавливали сплошной слой герметика,визуально контролируя отсутствие разрывов. Лицевую сторону алюминиевойподложки прижимали к клеевому слою, затем микрочип переворачивалиалюминиевой пластиной вниз, прижимали с усилием 1–2 кг до полногорастекания клеевого шва, центрировали расположение пластины относительноокна пластиковой подложки.
Готовый микрочип помещали в чашку Петри и~ 60 ~оставляли на ночь при комнатной температуре для завершения полимеризациисиликонового герметика.СобранныетакимобразоммикрочипыисплользовалидляОТПЦРисследований на жидких реактивах. Для того, чтобы подготовить микрочипы длялиофилизацииреактивовстадиюгидрофилизациипропускали,таккакстабилизаторы, которые использовались в процессе лиофилизации полностьюсправились с приданием гидрофильных свойств поверхности алюминия внутримикрореакторов.II.3.
Плазмохимическое осаждение покрытий на поверхности алюминиевойпластины и методы исследования полученных пленокII.3.1. Оборудование и реактивы для плазмохимического осажденияПлазмохимический синтез и очистка алюминиевых пластин проводились вустановке Diener Pico (Германия) с высокочастотным генератором (40 кГц / 200Вт) (рис.
25). Диаметр камеры составлял 150 мм, глубина: 320 мм, объем камеры:5 литров, подвод газа осуществлялся с помощью двух регуляторов расхода сигольчатыми клапанами. Ввод в камеру веществ с температурой кипения ниже130 °С производился путем его впрыскивания из отделения для жидкихмономеров.Рис. 25. Установка для плзамохимического синтеза пленок на поверхности алюминия.~ 61 ~Для ПХО также использовали генератор кислорода (Oxy 6000, Bitmos).Реактивы для ПХО: баллон c Аргоном (х/ч), ГМДС (Aldrich, х/ч), баллон сацетиленом (тех/ч).II.3.2. Методика проведения ПХО на поверхности алюминиевых микрочиповПодготовка пластин к плазмохимическому синтезуДо начала эксперимента камеру прожигали в низкотемпературной (50 – 60°С) плазме кислорода в течение 30 мин для очистки. Затем обезжиренныепластины размещали на подложке в камере генератора плазмы и закрываликамеру.Обработка в плазме аргонаНа регуляторе игольчатого насоса устанавливали объемную скорость потокааргона на 25 мл/мин и продували камеру до установки постоянного значениядавления (16 Па), затем устанавливали значение объемной скорости потока аргонана 5 мл/мин, значение мощности генератора на 100% (200 Вт), время обработки на5 мин и включали генератор.Обработка в плазме кислородаВключалигенераторкислорода,устанавливализначение 0.2л/мин,устанавливали скорость подачи кислорода 10 мл/мин и продували камеру втечение 5 минут.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
