Диссертация (1150270), страница 16
Текст из файла (страница 16)
Температура препарата не должнапревысить 0 °С (в случае использования в качестве растворителя воды) до тогомомента, пока давление в системе не опустится до уровня тройной точки воды, т.е. до 611 Па [157].В предыдущих наших работах [160] предложен метод лиофилизации ПЦРреактивовнаповерхностимикрочиповизкремния.Растворреактивовзамораживали с помощью элемента Пельтье и высушивали при пониженномдавлении. Данная установка позволяла проводить лиофилизацию ПЦР реагентов,но обладала низкой производительностью: для изготовления одного чипатребовалось около 1.5 часов. Для повышения производительности процессалиофилизациипозволиларазработанапроводитьноваяэкспериментальнаяодновременнуюустановка,иммобилизациюПЦРкотораяреагентоводновременно для шестнадцати микрочипов.
В случае данной установкинаблюдались следующие зависимости температуры и давления от времени (рис.46).~ 106 ~Рис. 46. Графики зависимости десятичного логарифма давления (а) и температуры (б) отвремени внутри рабочей камеры для лиофилизации ПЦР-реагентов.Из полученных зависимостей видно, что давление достигает значения 611 Пав среднем за 5 минут в то время, как температура остается отрицательной напротяжении 45 минут. Характер зависимости температуры от времени обусловлентем, что первоначально на показания термодатчика влияет воздух внешней средытемпературы, находящийся в рабочей камере. При понижении давления показаниятермодатчика определяется уже только хладагентом, и температура доходит доминимальногозначения.Последующийпостепенныйросттемпературыобусловлен частичным теплообменом системы с окружающей средой.Отметим,чтотемператураплавленияраствора,содержащегостабилизирующие компоненты, оценена в предварительных экспериментах, исоставила –2 °С.
Таким образом, установлено, что хладагент позволяет сохранитьтемпературу ниже температуры плавления до момента достижения давления 611Па, после чего возможна только сублимация растворителя, но не его таяние.~ 107 ~IV.3. Оптимизация времени лиофилизации ПЦР-реагентов вэкспериментальной установкеДля того, чтобы оптимизировать время лиофилизации, произведеныконтрольные взвешивания чипов и сухого лиофильного остатка. Из рис.
47следует, что основная масса растворителя сублимируется спустя 15 минут. Через45 минут наблюдается незначительное падение массы. Лиофилизация в течение120 минут не приводит к дополнительной сублимации. Таким образом, 45 минутдостаточно для полной лиофилизации реагентов на поверхности микрочипа.Такой подход более эффективен в сравнении с методикой лиофилизации сосушителем, которую использовали в предыдущих работах.24,70124,6824,6624,6424,62m, g24,6024,5824,5624,54324,52524,5024,48050100150200250300T, minРис. 47. График зависимости массы шести микрочипов от времени лиофилизации: 1 – массамикрочипов с жидкой лиофильной смесью; 5 – масса пустых микрочипов 3 – оптимальноевремя лиофилизации (45 минут).Полученное время лиофилизации позволяет вычислить производительностьпроцесса при массовом производстве микрочипов на подобной установке, исоставляет приблизительно 21 микрочип, что в 32 раза больше, чем напредыдущей установке и является приемлемым для пилотного производственногоучастка.~ 108 ~IV.4.
Сравнение методов иммобилизации ПЦР-реагентов на поверхностиалюминиевых микрочиповИзвестно, что способ иммобилизации реагентов может влиять не только наплотность полученного слоя, но и на физико-химические свойства самихстабилизируемых белков. Для того, чтобы оценить подобное влияние на ПЦРреагенты и на их дальнейшую реакционную способность, проведено сравнениедвухспособовиммобилизацииреагентов,аименно:лиофилизациивклассическом понимании (сублимация растворителя при пониженном давлении) иимпрегнирования, то есть испарения растворителя (также при пониженномдавлении).В качестве модельных ДНК тест-систем выбраны Mycoplasma hominis (ROX), и глобин (ROX и FAM). В реакторы трех микрочипов поместили реагенты дляпроведения ПЦР и стандартный стабилизатор для ДНК (рис.
48).Рис. 48. Схема микрочипа, содержащего иммобилизованные тест-системы для оценкиэффективности лиофилизации и испарения растворителя.Микрочипы с внесенными реагентами подготовили для лиофилизацииразными способами: одну часть микрочипов заморозили при температуре –18 °С,вторую — при температуре –30 °С, а третью часть не замораживали. Первые двечасти микрочипов поместили на поверхность хладагента для того, чтобы~ 109 ~поддержать начальные температуры, а третий тип поместили в установку безхладагента. Процесс иммобилизации проводили в течение 45 минут.
Дляпроведения контрольной ПЦР использовали алюминиевый микрочип с жидкимиреагентами.Стоит отметить, что методика ввода проб при использовании жидких ииммобилизованных реактивов при проведении ПЦР отличается. В случае жидкихреактивов 9 мкл пробы смешивали с 16 мкл ПЦР смеси. Для микрочипа симмобилизированными реактивами 9 мкл пробы смешивали с 1 мкл ПЦР-буфераи вводили в микрочип. Таким образом, в случае ПЦР с использованием жидкихреактивов начальная концентрация амплифицируемого участка ДНК заведомоменьше. Для того, чтобы корректно провести сравнение разных методик, стоитпринять во внимание дополнительные расчеты. Так, в предположении о 100%эффективности ПЦР, (т.е.
удвоение количества ампликонов за каждый цикл),полученные пороговые циклы можно пересчитать, используя формулу:Ctкорр = log2(2Ct эксп × (xэксп/xтеор)),где ; Ctэксп — экспериментально полученное значение порогового цикла; Ct корр —значение порогового цикла после пересчета; xэксп — начальная концентрацияплазмиды; xкорр.
— значение начальной концентрации плазмиды, на котороепроизводится пересчет .В табл. 11 представлены результаты проведенных ПЦР. В первую очередьстоитотметитьиспользованиенесомненноеиммобилизованныхпреимуществореактивовнепредложеннойпривелопороговых циклов ПЦР, по сравнению с жидкими реактивами.ксистемы:увеличению~ 110 ~Таблица 11.
Пороговые циклы ПЦР для модельных тест-систем в случае разных методовиммобилизации реактивовТест-системаПороговые циклы [Сt] (n = 10, P = 0.95)Иммобилизованные реактивыЖидкие реактивы–30 °С–18 °С+20 °СGl ROX26.3 ± 0.226.4 ± 0.325.9 ± 0.426.8 ± 0.5Gl FAM26.3 ± 0.226.7 ± 0.526.4 ± 0.226.5 ± 0.4MH FAM26.1 ± 0.426.6 ± 0.926.7 ± 0.327.3 ± 0.9Усредненные ПЦР кривые (по 30 отдельным анализам для каждого случая)модельных тест-систем в исходной и дифференциальной формах приведены нарис.
49. Как видно из графиков, реактивы, которые предварительно заморозили до–30 °С показали усиленный флуоресцентный сигнал, из чего можно сделатьвывод, что в процессе лиофилизации все биологически-активные компонентыПЦР подверглись лишь незначительной деградации. Вероятно, что прилиофильном подходе к иммобилизации полученный слой обладает более плотнойи устойчивой структурой, что позволяет реактивам работать эффективнее, чем вслучае испарения растворителя из матрицы стабилизатора.
Отметим, что оба типафлурисцентных зондов показали одинаковые тенденции, что сведетельствует оботсутствии выгорания зонда или других фото-деструктивных процессов во времялиофилизиации реактивов.~ 111 ~АБ9003000250020004800370026002400dII, e.u.10003500115004130020010050000-100-200-5000102030104020304050NNРис. 49. А) усредненные ПЦР-кривые для тест-системы Mycoplasma hominis (FAM) и Б) –усредненные ПЦР-кривые в дифференциальном виде для тест-системы глобин (FAM): 1 —жидкие реактивы; 2 — иммобилизированные реактивы без предварительного замораживания; 3— лиофилизированные реактивы с предварительным замораживанием до –18 °С; 4 —лиофилизированные реактивы с предварительным замораживанием до –30 °С.Кроме значения порогового цикла важной характеристикой является такжевеличина эффективности ПЦР, которую можно оценить по углу наклоналинейного участка ПЦР-кривой: чем больше значение а, тем более эффективнопроходит амплификация.
С целью сравнить эффективность ПЦР, проводимых сиспользованиемреактивовиммобилизованныхразличнымиспособамирассчитаны значения угловых коэффициентов кривых, которые приведены в табл.12.Таблица 12. Значения угловых коэффициентов ПЦР-кривых на линейном участке в зависимостиот условий иммобилизации реактивовТест-системаЗначение а (n = 10, P = 0.95)Метод иммобилизации–30 °С–18 °С+20 °СGl ROX780 ± 80710 ± 75620 ± 20Gl FAM810 ± 40720 ± 80600 ± 22MH FAM200 ± 14190 ± 20160 ± 11~ 112 ~Как видно из таблицы, наиболее высокие значения углового коэффициенталинейного участка ПЦР, соответствующие максимальной эффективности ПЦР,показали реактивы, предварительно замороженные в микрочипе до –30 °С.Вероятно, это связано с тем, что при глубокой заморозке матрица стабилизаторана основе трегалозы и воды формирует достаточно плотную структуру.
Придальнейшей сублимации растворителя с образовавшейся пленки ПЦР компонентынадежно связаны со стабилизаторами и не подвержены деградации.IV.5. Проверка длительности хранения лиофилизированных реактивов дляПЦР-анализа проб ДНКДля того чтобы в дальнейшем можно было адекватно оценить эффективностьстабилизаторов для систем, содержащих совместно ревертазу и полимеразу,стоило сначала проверить поведение микрочипов с лиофильными реактивами дляДНК-систем.Дляоценкисрокахраненияалюминиевыхмикрочиповслиофилизированными реактивами изготовили тестовую партию для тест-системыГлобин (на красителе FAM).
Микрочипы защищенные полимерной пленкойхранились при комнатной температуре более двух месяцев. Из полученныхданных выяснилось, что значения порогового цикла ПЦР при хранении меняетсянезначительно. При дальнейшем хранении наблюдалось небольшое снижениеэффективности (рис. 50) реакции, хотя она оставалась достаточно высокой дляпроведения качественного анализа на алюминиевых микрочипах.~ 113 ~Рис. 50. Зависимость значения максимума производной аналитического сигнала от срокахранения ПЦР реактивов.Таким образом, собранная экспериментальная установка успешно справиласьс задачей иммобилизации ПЦР реагентов на примере ДНК-систем путемлиофилизации.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
