Диссертация (1150270), страница 17
Текст из файла (страница 17)
Для применения разработанного подхода для РНК следовало дляначала изучить влияние процесса высушивание на стабильность двух ферментов,которые использовались в ОТПЦР.~ 114 ~V.Иммобилизация ОТПЦР реактивов в микрореакторах алюминиевогомикрочипаV.1. Исследование влияния процесса лиофилизации на активностьревертазыЧтобы определить влияние стабилизаторов на ревертазу а также систему,которая содержит оба фермента одновременно, для начала следовало провестииспытания в динамических условиях (жидкие реактивы). Состав и концентрациикомпонентов раствора стабилизаторов №1 (концентрации трегалозы, ПВП иTween 20 составляют соответственно 55.2, 7.6 и 4.4 ммоль/л), разрабатывалисьдляпроведенияанализаДНКнаиммобилизированныхреактивахииспользовались в предыдущих экспериментах по подбору условий лиофилизации.Однако установлено, что для стабилизации ревертазы компонентов стандартногораствора стабилизаторов недостаточно.
Так, на рис. 51 при анализе пробы одной итой же концентрации РНК наблюдается отставание ПЦР-кривых на 8 пороговыхциклов в случае жидкого и иммобилизированого фермента. Таким, образом,ревертаза деградирует в процессе лиофилизации настолько, что кажущаясяразница концентраций составляет приблизительно 300 раз.Рис. 51.
Усредненные кривые ПЦР, полученные в ходе исследования влияния процессалиофилизации на стабильность ревертазы.~ 115 ~Для дополнительной стабилизации двухферментной системы предложенодобавитькстабилизирующимкомпонентамрастворБСА,активноиспользующийся для улучшения работы различных белков и ферментов ипредотвращения их адгезии к стенкам сосудов в результате конкурентнойсорбции [108]. Последнее свойство БСА особенно играет особенную роль вданной работе, так как взаимодействие белков с активными центрами наалюминиевой подложке микрочипа может привести к инактивации ферментов, икак следствие, ингибированию ОТПЦР.Для оценки влияния раствора БСА на стабилизацию ОТПЦР-реактивовизготовили серию алюминиевых микрочипов с лиофильными реактивами. Вмирореакторахсериивысушилисмесикаксостандартнымрастворомстабилизаторов № 1, так и с добавлением раствора БСА (1 мг/мл).
При этомполовина ячеек содержала ревертазу в иммобилизированном виде, а в другуюполовину ревертазу добавляли непосредственно перед анализом (рис. 52).Рис.52. Схема микрочипа, содержащего иммобилизованные реактивы с растворамистабилизаторов для проведения ОТПЦР.
1— пустой ряд для проведения ОТПЦР на жидкихреактивах, 2 — раствор стаб. №1. + БСА 1 мг/мл без иммобилизации ревертазы, 3 — растворстаб. №1. + БСА 1 мг/мл с иммобилизированной ревертазой, 4 — раствор стаб. №1. безиммобилизации ревертазы, 5 — раствор стаб. №1. с иммобилизированной ревертазой.Целью лиофилизации части реагентов только со стандартным растворомстабилизаторов явилось показать разницу в сохранении ферментативных свойствревертазы при иммобилизации реактивов с использованием альбумина и без негов одинаковых условиях проведения эксперимента. Для получения опорного~ 116 ~значения порогового цикла ОТПЦР также проводилась на жидких реактивах безстабилизаторов (рис. 53).Рис.53 Усредненные кривые ПЦР, полученные в ходе исследования влияния процессалиофилизации на стабильность ревертазы.
1— ПЦР-смесь, 2 — смесь стабилизатора №1. + БСА1 мг/мл без иммобилизации ревертазы, 3 — смесь стабилизатора. №1. + БСА 1 мг/мл симмобилизированной ревертазой, 4 — смесь стабилизатора №1. без иммобилизации ревертазы,5 — смесь стабилизатора №1. с иммобилизированной ревертазой.Таблица 13. Значения пороговых циклов ОТПЦР в зависимости от смеси стабилизаторовСостав лиофильного раствораИммобилизацияревертазыПороговыйцикл(n = 7, P = 0.95)Раствор стабилизаторов №1+28.31 ± 2.21Раствор стабилизаторов №1–25.22 ± 1.93+21.03 ± 1.20–21.25 ± 1.32Раствор стабилизаторов №1 +БСА 1 мг/млРаствор стабилизаторов №1 +БСА 1 мг/млПЦР – смесь19.35 ± 0.56Из приведенных данных в табл.
13 видно, что добавление раствора БСА всмесьстабилизаторов№1обеспечиваетболееэффективноесохранениеактивности ревертазы по сравнению с использованием только стандартной смеси~ 117 ~стабилизаторов. Таким образом, дальнейшее исследование было направлено наподбор оптимальных концентраций стандартного раствора стабилизаторов ираствора БСА, которые обеспечивали бы наилучшие показатели работыполимеразы и ревертазы при их лиофилизации в смеси с остальными ОТПЦРреагентами.V.2. Исследование влияния модельной смеси стабилизаторов на ОТПЦРреактивы в жидкой формеС целью подбора концентрации компонентов раствора стабилизаторов атакжедляоценкивозможногоингибированияОТПЦР,котороеможетнаблюдаться при высоких концентрациях стабилизаторов, проводили проверкувоздействия раствора на жидкие реактивы.В ходе предварительных экспериментов замечено, что проведение ОТПЦР сменее концентрированным раствором стабилизаторов №1 приводило к большейэффективности реакции и меньшим пороговым циклам (рис.
54).Рис. 54. Усредненные ПЦР- кривые, полученные в алюминиевых микрочипах симмобилизированными реактивами с использованием различных концентраций растворастабилизаторов. 1 — раствор стабилизаторов №3, 2 — раствор стабилизаторов №2, 3 — растворстабилизаторов №1.~ 118 ~На основании данных, представленных выше, сделан вывод, что дляоптимизации состава раствора стабилизаторов необходимо не только исследоватьвлияние альбумина на жидкие ОТПЦР-реактивы, но и провести эксперименты сварьированием концентрации стандартного раствора стабилизаторов.Таким образом, далее провели эксперимент по подбору оптимальнойконцентрациирастворастабилизатороввсоответствииспропорциями,ОТПЦР (7.5мкл раствораприведенными ниже.К реакционнойсмеси дляпроведениястабилизаторов, 3.75 мкл ДНТФ, 3.6 мкл раствора праймеров, по 0.75 мклполимеразы и ревертазы и 14.55 мкл воды) добавляли пробу в объеме 18 мкл.
Длякорректного сравнения пороговых циклов ОТПЦР проводилась также на жидкихреактивах без стабилизаторов. Полученные в ходе экспериментов усредненныепороговые циклы представлены в табл. 14.Таблица 14. Значения пороговых циклов ОТПЦР в зависимости от концентрацииосновных стабилизаторовРастворПороговый циклстабилизаторов, номер(n = 7, P = 0.95)123.54 ± 0.18223.18 ± 0.25321.39 ± 0.21ПЦР-смесь19.99 ± 0.19УсредненныеПЦР-кривыедлястабилизаторов представлены на рис. 55.разныхконцентрацийосновных~ 119 ~Рис. 55. Усредненные кривые ПЦР, полученные в ходе эксперимента с использованием жидкихреактивов.
1 — ПЦР-смесь, 2 — раствор стабилизаторов №3, 3 — раствор стабилизаторов №2,4 — раствор стабилизаторов №1.Из представленных результатов следует, что при проведении реакции нажидких реактивах раствор стабилизаторов № 3 обладает наименьшим влияниемназначениеэффективностиОТПЦР.Приэтомиспользованиеболееконцентрированных растворов (раствор стабилизаторов № 1) несколько снижаетэффективность и увеличивает пороговые циклы. Такое поведение легкообъяснить, учитывая, что при понижении концентрациистабилизаторовферменты инактивируются в меньшей степени. Однако, с другой стороны,понижение концентрации стабилизаторов может привести к сокращению сроковхранения алюминиевых микрочипов.На следующем этапе следовало оптимизироватьконцентрацию БСА.
Крастворам стабилизаторов №2 и №3 добавляли разное количество БСА доконечных концентраций 2, 0.2, 0.02, мг/мл. Далее к ОТПЦР смеси, содержащей7.5 мкл раствора разных стабилизаторов, 3.75 мкл ДНТФ, 3.6 мкл растворапраймеров, по 0.75 мкл полимеразы и ревертазы и 14.55 мкл воды, добавляли РНКпробы в объеме 18 мкл. Для получения рефернтного порогового цикла ОТПЦРпроводили также на жидких реактивах без стабилизаторов. Полученные в ходе~ 120 ~экспериментов усредненные пороговые циклы представлены в табл.
15.Усредненные ПЦР-кривые, полученные в ходе проведения реакций на партиимикрочипов с лиофилизированными реактивами представлены на рис. 56 и 57.Таблица № 15. Значения пороговых циклов в экспериментах по добавкам БСА (n = 7, P = 0.95)Раствор стабилизаторовРаствор стабилизаторов№3№2Пороговый циклПороговый цикл222.20 ± 0.0923.01 ± 0.410.222.09 ± 0.1023.22 ± 0.580.0222.53 ± 0.1125.15 ±0.93ПЦР-смесь22.08 ± 0.0822.07 ± 0.37Концентрациядобавки раствораБСА, мг/млРис. 56 Усредненные ПЦР-кривые, полученные в ходе эксперимента с использованием жидкихреактивов.
Раствор стабилизаторов № 3. 1 — ПЦР-смесь, 2 — добавка раствора БСА 2.0 мг/мл,3 — добавка раствора БСА 0.2 мг/мл, 4 — добавка раствора БСА 0.02 мг/мл.~ 121 ~Рис. 57 Усредненные ПЦР-кривые, полученные в ходе эксперимента с использованием жидкихреактивов. Раствор стабилизаторов № 2. 1 — ПЦР-смесь, 2 — добавка раствора БСА 2.0 мг/мл,3 — добавка раствора БСА 0.2 мг/мл, 4 — добавка раствора БСА 0.02 мг/мл.Из полученных данных видно, что добавление растворов стабилизаторов ираствора БСА представленных концентраций не ингибирует ОТПЦР на жидкихреактивах.
Исходя из результатов, приведенных в табл. 14 и 15 видно, чтонаименьшийпороговыйциклвдинамическихусловияхдаетрастворстабилизаторов №3, как с добавлением БСА, так и без него. Однако обэффективности стабилизации полимеразы и ревертазы в условиях сухихреагентов можно судить только при проведении реакции на иммобилизированныхреагентах, так как в высушенном состоянии содержания стабилизаторов врастворе № 3 может быть недостаточно для сохранения активности ферментов вовремени. Аналогичным образом следует проверить и эффект добавки раствораБСА – несмотря на то, что раствор стабилизаторов № 3 с концентрациями БСА2.0 и 0.2 мг/мл давал лучшие характеристики процесса протекания ОТПЦР посравнению с раствором стабилизаторов №2, в полной мере исследоватьстабилизирующее действие и обосновать выбор именного такого состава можнотолько при лиофилизации реактивов на алюминиевых микрочипах.
Однако~ 122 ~данные о взаимодействии БСА и жидких ОТПЦР-реактивов позволили оценитьвлияние именно химической природы выбранных стабилизаторов и убедиться втом, что в пределе выбранных концентраций ингибирование ОТПЦР отсутствует.V.3. Результаты лиофилизации ОТПЦР-реактивов с модельной смесьюстабилизаторовС целью проверки эффективности стабилизации реактивов растворыосновных стабилизаторов № 2 и №3 с добавками раствора БСА 2.0; 0.2; 0.02мг/мл использовали для лиофилизации партии микрочипов в модельнойустановке по методике, разработанной для ДНК тест-систем. При выбореоптимальной концентрации стабилизаторов на первом этапе критерием оценкиявлялся внешний вид иммобилизованной в микрореакторе смеси.
Так, хорошовысушенная смесь должна надежно удерживаться в микрореакторе, а также необразовывать кристаллический осадок в процессе лиофилизации. Следующимэтапом по выбору оптимальной концентрации стабилизаторов явилась оценкасохранениясвойствиммобилизованныхреактивов,проведеннаяпутемсопоставления величин пороговых циклов ОТПЦР с иммобилизированнымиреактивами и с жидкими реактивами без стабилизаторов.Дляоценкиморфологическиххарактеристикполученныхпленокиспользовали СЭМ. В результате исследования выявили, что критерииоднородности пленок и отсутствия кристаллов отвечали все лиофилизированныереагенты, не зависимо от использованных растворов стабилизаторов и БСА.
Всеобразцы представляли собой прозрачные стекловидные массы, достаточно прочноудерживающиеся в микрореакторах. Следует отметить, что для проведенияданногоСЭМ-исследованияиспользоваликремниевыймикрочипввидувозможности получения аккуратного скола поверхности на данном материале(рис. 58).~ 123 ~абРис. 58 СЭМ изображение иммобилизированных реактивов в ячейке микрочипа сиспользованием раствора стабилизаторов №1 (а) и №2 (б).При использовании концентрированного раствора стабилизаторов (№1)ввиду его большой вязкости лиофильный остаток представлял отдельные каплина поверхности микрочипа (рис.58 б). Лиофильные остатки на основе болееразбавленных растворов стабилизаторов оказались лишены этого отрицательногоэффекта и распределились по всей поверхности микрореактора равномерно.Толщина лиофильного остатка позволила также изучить его морфологиюотдельно от алюминиевого микрочипа.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
