Автореферат (1150269), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Таким образом, исходя из значений погрешности (для разбавленного стабилизатора №3погрешностьминимальная),атакжесцельюсокращения расходареактивов, дляиммобилизации реактивов выбран раствор стабилизаторов № 3.В методе ОТПЦР положительный контроль применяется, чтобы удостовериться в том, чтореактивы работают с необходимой для проведения анализа эффективностью. Так, в случае, еслиположительный контроль не дал ожидаемого результата, результаты всех проб в этой сериисчитаютсянеприемлемыми:всеотрицательныепробысчитаютсяпотенциальноложноотрицательными.
Иммобилизация положительного контроля позволяет минимизироватьручную работу исследователя за счет избегания приготовления соответствующих растворов, атакже адекватно оценить работоспособность реактивов ввиду идентичных условий их храненияс условиями хранения контролей, поэтому следующим этапом создания комплекснойиммобилизированнойтест-системысталопроведениеиспытанийполиофилизацииположительного контроля. В случае вирусов птиц, в качестве положительной пробы взяливакцину ИБК штамм H120, которая представляла ослабленный вирус инфекционного бронхита,а также искусственную плазмиду вируса в разных концентрациях.~ 18 ~Таблица 6. Значения пороговых циклов ОТПЦР в условияхускоренного старения (35 °С) для полностью иммобилизированнойРНК тест-системы, включая положительные контроли для анализавируса ИБККакПороговый циклплазмидавакцинаДлительность12012старения, днипкг/мклпкг/мкл013.921видноизпредставленных данных (табл.
6),раствор стабилизаторов № 3 сcо×10–3cо×10–417.0425.1328.37эффективно стабилизировать не14.0717.2125.9131.25только214.3917.5127.5231.99положительные314.6517.8629.233.75вакцину414.9718.1231.8235.57плазмиду.515.3118.4333.1236.14лиофилизации615.6218.9234.8137.82наблюдаетсядобавкойБСАпозволяетреактивы,ноконтроливирусаи–икДНКОднако,привакцины,болеекрутаязависимость порогового цикла отпродолжительности хранения, что, безусловно, связано с низкой термостабильностью РНКфрагментов вакцины. Пороговые циклы для двух представленных концентраций вакциныотличаются, в среднем, на 3,5 цикла. В соответствии с формулой для пересчета сроковискусственного старения в срок хранения следует, что 6 дней хранения микрочипов слиофилизированными реактивами при + 35 ᵒС соответствуют 103 суткам хранения при + 4 ᵒС.Таким образом, при таком сроке хранения, раствор вакцины, разбавленный в 10 4 разотносительно исходного раствора может использоваться в качестве внутреннего контроля.Оцененные значения эффективности ПЦР находились в пределах от 95 до 100% напротяжении всего эксперимента по состариванию микрочипа с лиофилизированнымиреактивами, что указывает на отсутствие значительной потери активности ферментов, а такжеподтверждает инертность поверхности алюминиевого микрочипа.В главе 6 проведена оптимизация пробоподготовки реальных образцов вирусов птиц,представляющих из себя пассажи патологического материала на курином эмбрионе.АналитическоеприменениеОТПЦРвветеринарныхисследованияхчастотребуетоперативности ввиду скорого распространения инфекций.
Однако, для того, чтобы обеспечитьпробоподготовку образцов стандартными коммерческими наборами на основе сорбционногоили преципитационного подходов, нужно использоватьультрацентрифугу с высокоймощностью. Для того, чтобы обеспечить микрочиповую систему для анализа вирусов ИБВ иНДВ в такой же мере мобильной и экспрессной пробоподготовкой, в данной работе былапроведена оптимизация методики выделения РНК с помощью магнитного сорбента, которая не~ 19 ~требовала больших временных затрат и мощной центрифуги. В ходе исследования былиоптимизированы стадия лизиса, сорбции, очистки и элюирования искомой РНК с поверхностисорбента. Было показано, что по сравнению с аналогичной методикой для выделения ДНК вслучае вирусов требуются более мягкие температурные режимы лизиса, более тщательнаяочистка от гидрофильных и гидрофобных примесей.
В таблице 7 представлены результатысравнения оптимизированного подхода на основе магнитного сорбента с методикой для ДНК,которую пробовали использовать для РНК без оптимизации.Таблица 7. Результаты выделения NDV и IBV с помощьюмагнитных частиц до и после оптимизациипробаНБ до оптимизацииНБ после оптимизацииИБК до оптимизацииИБК после оптимизацииСt29.69 ± 0.4621.25 ± 0.1131.5± 1.7721.62 ± 0.41чистотавыделения(А260/А280)1.241.441.531.58Так,указывают,данныечтосПЦРпомощьюподбора правильных параметровудалосьувеличитьконцентрацию РНК в пробе натри порядка. После оптимизации всех стадий пробоподготовки было проведено сравнение повременным затратам а также количеству ручных операций между предложенной методикой икоммерчески доступными наборами.
Для того, чтобы провести пробоподготовку стандартнымиметодами, требовалось 40-45 минут а также 52 (РИБО-ПРЕП) и 62 (РИБО-СОРБ) ручныхоперации. В то же время для методики на основе магнитного сорбента нужно всего 25 минут и24 ручных операции. Таким образом, трудовые затраты на пробоподготовку образцовсократились почти в два раза. Применение магнитного сорбента позволило значительносократить энергетические затраты ввиду отсутствия необходимости использовать мощную идорогостоящую ультрацентрифугу.Оценка чувствительности предложенной аналитической системы с лиофилизированнымиреактивами, включая стадию пробоподготовки показала значение порядка 100 копий/мкл.
Такаячувствительность встречается и для стандартной пробирочной ОТПЦР при анализе вирусов.Таким образом, разработанная микрочиповая аналитическая система может использоваться дляскрининга большого количества проб, а также для качественного определения вирусов НБ иИБК. При этом, в сравнении с классическими методами время анализа сокращается в десяткираз, а предложенная схема пробоподготовки позволяет проводить анализ непосредственно внебольших ветеринарных лабораториях, избегая транспортировки термолабильной РНК.~ 20 ~Выводы1.Разработана аналитическая система с микрочипами из алюминия, поверхностькоторых модифицирована методом плазмохимического осаждения, содержащими полностьюлиофилизированные реактивы для определения РНК методом ОТПЦР.2.Эффективность ПЦР с лиофилизированными ОТПЦР реактивами увеличена допредельно возможной величины 982% за счет модификации поверхности алюминиевыхмикрочипов с помощью метода плазмохимического синтеза углеродсодержащих пленок, чтопозволилосущественноувеличитьпроизводительностьитехнологичностьпроцессапроизводства микрочипов.3.Разработан способ и создана экспериментальная установка для лиофилизацииОТПЦР реактивов в алюминиевых микрочипах.4.Достигнуты достаточно длительные для практического применения срокихранения микрочипов с полностью лиофилизированными реактивами и контрольнымиобразцами (8 месяцев), что позволило их использоватьпри проведении анализа реальныхобразцов.5.Разработана методика пробоподготовки биологического материала, содержащеговирусы, с использованием магнитного сорбента для определения РНК с помощьюмикрочиповой ОТПЦР.
На примере обнаружения вирусов птиц в реальных образцах показано,что разработанная микрочиповая аналитическая система позволяет существенно сократитьвремя анализа и затраты на дорогостоящие реактивы и оборудование.Материалы диссертации опубликованы в следующих работах:1. А.О. Суворова, П.Н. Машьянов, Ю.В. Ашина, М.Н. Сляднев, А.А. Ганеев. Разработкамикрочиповой аналитической системы с лиофилизированными ПЦР реагентами валюминиевых микрочипах, модифицированных методом плазменно-химического осаждения //Аналитика и контроль, 2015.
Т. 19. № 4, 1-9.2. Ю.С. Ашина, А.О. Суворова, М.Н. Сляднев. Плазмохимический синтезуглеродсодержащих пленок на поверхности алюминиевых микрочипов для проведенияполимеразной цепной реакции. // Заводская лаборатория, 2015, Т. 81, №5, 32-29.3. Suvorova O; Slyadnev M; Perchik A; Navolotskii D; Mushnikov N. Rapid determination ofsexually transmitted infections by real-time polymerase chain reaction using microchip analyzer//Engineering – 2012. – V. 4, 1-3.~ 21 ~4. A.O.
Suvorova, M.N. Slyadnev Determination of sexually transmitted infections by real-timePCR: new practical improvements // 1-ая Зимняя молодежная школа-конференция смеждународным участием «Новые методы аналитической химии», Санкт-Петербург 2013, c. 265. Ашина Ю.С., Суворова А.О. Получение и исследование новых DLC-покрытий дляпассивации поверхности алюминиевых ПЦР-микрочипов // VII Всероссийская конференция«Менделеев 2013», Санкт-Петербург, 2013, Т.1, 119-120.6. A.O. Suvorova.
Microchip real-time PCR analyzer for clinical diagnostic // VII Всероссийскаяконференция «Менделеев 2013», Санкт-Петербург, 2013, T.2, 15-16.7. Машьянов П.Н., Суворова А.О. Иммобилизация ПЦР-реагентов на поверхностиалюминиевых ПЦР-микрочипов // VII Всероссийская конференция «Менделеев 2013», СанктПетербург, 2013, 131-132.8. A.O. Suvorova, J.S. Ashyna, M.N. Sliadnev.
Microchip reverse transcription polymerase chainreaction for birds RNA viruses identification // VIII Всероссийская конференция «Менделеев2014», Санкт-Петербург, 2014, Т.2, 15-169. Кузьминова А.И., Константинова Г.О, Суворова А.О., Сляднев М.Н. Оптимизацияусловий пробоподготовки биологического материала для определения РНК-вирусов птицметодом ОТ ПЦР // Химия и химическое образование ХХI века, Санкт Петербург 2015, 40.10. А.И. Кузьминова, Г.О.
Константинова, А.О. Суворова. Оптимизация условийпробоподготовки биологического метриала для определения РНК-вирусов птиц методом ОТПЦР // VIII Всероссийская конференция «Менделеев 2014», Санкт-Петербург, 2014, Т.1, 297298.11. Souvorova A, Ashina J, Kuzminova A, Konstantinova G, Slyadnev M. Reverse transcriptionPolymerase chain reaction using microchip analyzer for RNA viruses determination // 97th CanadianChemistry Conference and Exhibition, Vancouver, 2014, 1453..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
