Диссертация (1150004)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Санкт-Петербургский государственный университетНа правах рукописиМатусевич Олег ВладимировичСИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫВИРУСА ГРИППА А02.00.10 – биоорганическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:д.х.н., проф. Титов М. И.Санкт-Петербург2013ОГЛАВЛЕНИЕ1. ВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 42. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .....................................................................................

72.1 Пептиды как потенциальные лекарственные средства.................................. 72.1.1 Преимущества и недостатки терапевтических пептидов........................ 72.1.2 Химические стратегии улучшения биологической активности,специфичности и стабильности пептидов ......................................................... 82.2 Синтез пептидов............................................................................................... 122.3 Вирусные белки – потенциальные лекарственные мишени. ......................

162.3.1 Гемагглютинин (НА)................................................................................. 242.3.2 Нейраминидаза (NA). ................................................................................ 252.3.3 Протонный канал М2. ............................................................................... 272.3.4 Нуклеопротеин (NP) ..................................................................................

292.3.5 Белки М1 и М42......................................................................................... 322.3.6 Неструктурный белок 1 (NS1).................................................................. 322.3.7 Белок ядерного экспорта (NEP или NS2)................................................ 332.3.8 РНК-полимераза ........................................................................................ 332.3.8.1 Структурная организация и функции……………………………..342.3.8.2 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РА…………………………...372.3.8.3 Перспективы разработки противовирусных средств…………….412.3.8.4 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РВ2………………………….432.3.9 Белки PB1-F2 и PB1-F3 (N40) ..................................................................

462.3.10 Белки PA-X, PA-N155 и PA-N182 ......................................................... 473. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ........................................................................ 483.1 Синтез пептидов...............................................................................................

513.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепи ................................. 553.1.2 Конвергентный синтез .............................................................................. 583.2 Противовирусная активность пептидов ........................................................

594. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ ..................................................................... 644.1. Материалы и методы исследования .............................................................. 6424.2 Синтез пептидов............................................................................................... 715. ВЫВОДЫ .............................................................................................................

1036. ЗАКЛЮЧЕНИЕ ................................................................................................... 1047. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ ...................... 1058.СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................... 10731.

ВВЕДЕНИЕСреди респираторных вирусных инфекций вирус гриппа занимает особоеместо. По данным ВОЗ, ежегодная смертность от гриппа в мире составляет 250500 тысяч человек [1]. Наиболее опасным из трех типов этого вируса являетсявирус гриппа А: согласно [2], все пандемии гриппа с начала XX века понастоящее время были вызваны именно этим вирусом.Ввидунепредсказуемостимолекулярно-генетическихииммунологических характеристик новых эпидемических и пандемическихштаммов вируса гриппа А, защита, обеспечиваемая вакцинацией, не являетсядостаточно надежной, и химиотерапия сохраняет свою актуальность [3, 4].Главной проблемой химиотерапии является появление штаммов, устойчивых кдействию препаратов.

Так, известны штаммы, резистентные к оcельтамивиру,одному из основных противогриппозных препаратов. Поэтому необходимпоиск новых соединений, действующих на различных стадиях жизненногоцикла вируса гриппа [3, 4, 5].Перспективноймишеньюдляхимиотерапиигриппаявляютсяконсервативные белки: использование таких мишеней может позволить взначительной степени избежать проблемы формирования резистентности кпрепаратам. Одной из таких мишеней, не задействованной в современныхпрепаратах, использующихся в клинической практике, в случае вируса гриппаА является фермент РНК – полимераза, катализирующий синтез вирусной РНК.Цель работы: поиск пептидов из аминокислотной последовательностибелка РВ1, подавляющих репликацию вируса гриппа А. Для достиженияпоставленной цели в работе были решены следующие задачи:1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ12.

разработка синтеза целевых соединений3. тестирование синтезированных пептидов4.модификациянаиболееактивныхсоединенийбиологической активности4сцельюувеличенияНаучная новизна исследования:1. Разработан синтез 34 ранее неизвестных пептидов – фрагментов белка РВ1РНК-полимеразы вируса гриппа А.2. На основании изучения противовирусной активности синтезированныхсоединений на культуре клеток MDCK в отношении пандемического вирусагриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 впервые показано, что пептиды –фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1, а также ихпроизводные эффективно подавляют репликацию вируса гриппа.3.

Изучение флуоресцентно-меченого фрагмента 6-14 белка РВ1 показало, чтопрепарат действует внутри клетки на ранних стадиях репликации вирусагриппа.Практическая ценность работы. В ряду синтезированных пептидоввыявлены соединения с высокой противовирусной активностью, которые могутбыть использованы в качестве основы для создания лекарственных препаратовдля профилактики и лечения гриппа А. Получен патент на пептид, обладающийвысокой противовирусной активностью.На защиту выносятся результаты проведенного исследования,включающие:1.

выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1,входящих в состав РНК-полимеразы вируса гриппа А2. синтез 34 пептидов – фрагментов белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А3. изучение противовирусной активности синтезированных соединений накультуре клеток MDCK в отношении пандемического вируса гриппаA/California/07/2009 (H1N1) pdm094. выявлены соединения, эффективно подавляющие репликацию вируса гриппа ААпробация работы. Результаты работы представлены в 10 публикациях(2 статьи, 1 патент и тезисы 7 докладов). Статьи опубликованы в журналахВестник Санкт-Петербургского университета (2011, серия 4, вып. 2, С.155-161)и International Journal of Peptides (2013, vol.

2013, ID 370832). Материалыработы были доложены на 4 конференциях и 2 симпозиумах: Международной5конференции по химии “Main Trends of Chemistry at the Beginning of XXICentury” (С.-Петербург, 2009),V Всероссийской конференции “Химия всовременном мире”, (С.-Петербург, 2011), IV Российском симпозиуме “Белки ипептиды”(Казань,(Копенгаген,2010),2009),31-омЕвропейскомКонференциимолодыхпептидномсимпозиумеспециалистов“Грипп:эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение” (С.-Петербург, 2012),16-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых“Биология – наука ХХI века” (Пущино, 2012). Тезисы доклада на 31-омЕвропейском пептидном симпозиуме были опубликованы в Journal of PeptideScience (2010, v.

16, S1, p. 65).Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научномуруководителю, профессору М.И. Титову, коллективу лаборатории синтезапептидов: И.А. Глуздикову, С.К. Никольской, И.И. Елисееву, А.А. Краснощек,сотрудникам НИИ Гриппа: О.И. Киселеву, В.В. Зарубаеву, А.А. Штро, В.В.Егорову, Ю.П. Гармаю, А.В. Слите, М.И. Дюкову за неоценимую помощь иподдержку при выполнении диссертационной работы.62. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР2.1 Пептиды как потенциальные лекарственные средстваИспользуемые в настоящее время лекарственные препараты могут бытьразделены на следующие категории [6]: "малые" молекулы - природные илисинтетическиесоединениясмолекулярноймассой< 500Даивысокомолекулярные соединения с молекулярной массой, как правило, > 5000Да, к ним относятся белки, например, антитела, а также конъюгаты белков.Промежуточное положение в этой классификации занимают пептиды.Подавляющеебольшинствосовременныхлекарственныхсредствотносится к классу "малых" молекул, которые удовлетворяют одному изкритериев [7], необходимому для высокой биодоступности препарата припероральном применении: соединение должно обладать молекулярной массой< 500 Да.

Основными преимуществами таких соединений являются простота ирентабельностьсинтеза,высокаябиодоступностьприпероральномприменении и способность проникать через биологические мембраны [8]. К ихнедостаткам можно отнести способность накапливаться в тканях, образовыватьтоксичные продукты метаболизма, вызывающие или усиливающие побочныеэффекты.В этом отношении пептиды -многообещающий класс соединений,который способен объединить терапевтические преимущества"малых"молекул и белков [6]. Кроме того, пептиды являются естественнымирегуляторами различных процессов в организме.2.1.1 Преимущества и недостатки терапевтических пептидовВ качестве потенциальных лекарств пептиды обладают следующимипреимуществами по сравнению с белками, в том числе, антителами [9 - 11]: лучше проникают в ткани, в том числе, в опухоли в общем случае менее иммуногенны, чем рекомбинантные белки иантитела пептиды имеют более высокую активность на единицу массы7 более стабильны при храненииОсновными недостатками терапевтических пептидов являются [9, 12 - 14]: низкая биодоступность при пероральном применении препарата (обычнотребуется инъекция) Короткое время жизни в организме вследствие быстрого расщепленияпептидов протеолитическими ферментами пищеварительной системы иплазмы крови, а также вследствие почечного и печеночного клиренса низкая способность к пересечению физиологических барьеров высокая конформационная гибкость, которая иногда приводит кнедостаточной селективности при взаимодействиях с различными мишенями,что вызывает активацию нескольких мишеней и обусловливает побочныеэффекты возможный риск иммуногенных эффектов высокаястоимостьсинтезапептидоввсравнениис"малыми"молекуламиОдним из способов преодоления перечисленных выше недостатковпептидов могут быть химические модификации [15].2.1.2 Химические стратегии улучшения биологической активности,специфичности и стабильности пептидовПроцессы поглощения, распределения, метаболизма и экскреции играютключевую роль в определении характера потенциального лекарства и, такимобразом, его терапевтического эффекта [16].

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации