Диссертация (1150004), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Белок PB1-N40транслируется в той же рамке считывания, что и PB1, но с другого старт-кодонаи является вариантом белка PB1, укороченным с N-концана 39аминокислотных остатков. Его функции в настоящее время достовернонеизвестны [184].2.3.10 Белки PA-X, PA-N155 и PA-N182Сегментом 3 вирусного генома кодируются белки PA и PA-X, последнийспособен подавлять экспрессию клеточных генов, снижать вирулентность ирегулировать различные сигнальные пути в реакции организма на гриппознуюинфекцию. Белок PA-X образуется за счет сдвига рамки считывания в процессетрансляции белка PA и содержит N-концевую часть белка РА длиной в 191аминокислотный остаток и отличную от белка PA С-концевую часть длиной в60 или, реже, 40 аминокислотных остатков [73].Есть сообщения о том, что в клетках, инфицированных различнымиштаммами вируса гриппа А, синтезируются укороченные с N-конца вариантыбелка PA, обозначаемые как PA-N155 и PA-N182.
Эти белки образуются за счетначалатрансляциисодиннадцатогоитринадцатогостарт-кодоновсоответственно, находящихся в той рамке считывания, что и белок PA.Одновременная экспрессия белков PA-N155 и PA-N182 и субъединицполимеразы PB1 и PB2 не приводит к появлению полимеразной активности, нопри отсутствии белков PA-N155 и PA-N182 вирус размножается медленнее иобладает более низкой патогенностью [74].473.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВДляпоискааминокислотнойновыхпептидныхпоследовательностипротивовирусныхбелкаРВ1препаратов(штаммизA/HongKong/156/97(H5N1)) были выбраны выделенные на рисунке 16 области: 1-30,111-130,271-290,381-420,525-540.Этиконсервативныеобластивысокопатогенного штамма H5N1 и наиболее актуального A/California/07/2009(H1N1) pdm09 отличаются лишь на 1 неэквивалентную замену Met119Val.Рис. 16 Аминокислотная последовательность белка РВ1 вируса гриппа A/HongKong/156/97(H5N1) [185].
Серым цветом выделены выбранные для исследованияобласти.Из литературы известно, что наиболее важным для связывания с белкомРА является фрагмент 1-15 белка РВ1 [179]. Наличие в клетке фрагмента 1-25белка РВ1 подавляет репликацию вируса в клетке [174]. Авторы исследованийпри этом полагают, что пептидный ингибитор конкурирует с белком РВ1 засвязывание с белком РА. Учитывая вышеперечисленное, мы решили болеедетально изучить эту область.48При анализе первичной структуры N-концевой части белка РВ1 былоустановлено, что фрагмент 6-25 содержит зеркально-симметричный мотив(рисунок 17).
Из литературы известно, что такие мотивы чаще встречаютсявблизи функционально значимых участков белков [186].Рис. 17 Зеркально-симметричный мотив в структуре фрагмента 6-25 белка РВ1.Аминокислотные остатки в симметричных позициях обозначены жирным шрифтом, авзаимодействующие с белком РА подчёркнуты.Для изучения пространственной структуры фрагмента 6-25 сотрудникамилаборатории структурной и функциональной протеомики НИИ Гриппа былопроведено компьютерное моделирование структуры этого пептида методамимолекулярной динамики. По расчетным данным, соединение образуетструктурытипаβ-шпильки(рисунок18);аминокислотныеостатки,необходимые для стабилизации данной структуры, находятся в районефрагмента 6-13 [187].Рис.
18 Пространственная структура фрагмента 6-25 белка РВ1 по даннымкомпьютерного моделирования.49По результатам моделирования пространственной структуры фрагмента6-13 было установлено, что данный пептид склонен к образованию линейнойструктурыинеобразуетвнутримолекулярныесвязи.Наоснованиивышеизложенного мы предполагаем, что фрагменты 6-13 и 6-25 белка РВ1могутвзаимодействоватьдругсдругомвследствиеконкуренциизавнутримолекулярные связи фрагмента 6-13 с той частью молекулы пептида 625, которая образует β-структуру.
Таким образом возможна стабилизация NконцевойчастибелкаРВ1ввидеβ-структуры,препятствующейвзаимодействию белков РВ1 и РА, что, как следствие, будет приводить кингибированию вирусной репликации в клетке.Выбор пептидов, не принадлежащих N-концу белка РВ1, был во многомпроизвольным, при этомпринимались во внимание такие факторы, какгидрофобность, растворимость, способность проникать сквозь клеточнуюмембрану, наличие кластеров повторяющихся аминокислотных остатков.Так, например, фрагмент 525-540 белка РВ1 был выбран, посколькусодержит кластер из остатков аспарагина.
Известно, что кластеры остатковаспарагина или глутамина повышают склонность белков к образованиюамилоидных агрегатов, где преобладает β-складчатая структура [188, 189]. Наосновании вышесказанного было сделано предположение, что пептид РВ1 531540 может быть блокатором образования β-складчатой структуры и нарушатьстабильность соответствующего домена полноразмерного белка. По сходномупринципу был выбран участок 111-130, содержащий повтор глутамина, а такжеповтор остатков валина.Сравнениеразличныхвариантовпроводилосьсогласнорасчетаминдексов, предложенных в 2005 году Хэлбринком и соавторами [190].В результате для синтеза были выбраны следующие пептиды - фрагментыбелка PB1: 1-5, 1-25, 6-13, 6-14, 6-25, 14-25, 26-30, 111-130, 271-290, 381-386,381-390, 381-400, 391-400, 395-400, 411-420, 525-530, 525-535, 531-540.503.1 Синтез пептидовСинтезпептидовпроводилитвердофазнымметодомна2-хлортритилхлоридной и Ринк-амидной смолах по Fmoc-/t-Bu стратегии сиспользованием как стандартных методик последовательного наращиванияцепи, так и конвергентного подхода [44].
Очистку полученных пептидовпроводили методом препаративной обращеннофазной ВЭЖХ,их структураподтверждена масс-спектрометрически (ESI).Для фрагментов 6-13, 6-14, 26-30, 395-400 и 531-540 были полученыамиды, а также N-ацетилированные производные пептидов и их амидов.Аминокислотныепоследовательностисинтезированныхпроизводных представлены в таблицах 3 и 4 соответственно.51пептидовиихТаблица 3. Базовые пептиды 1-18№обозначенияпептидоваминокислотная последовательность12PB1 (1-5)PB1 (1-25)3PB1 (6-13)4PB1 (6-14)5PB1 (6-25)6PB1 (14-25)78PB1 (26-30)PB1(111-130)9PB1(271-290)1011PB1(381-386)PB1(381-390)H-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-OHH-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-||-Thr6-Leu7Leu8-Phe9-Leu10-Lys11-Val12-Pro13-||-Ala14Gln15-Asn16-Ala17-Ile18-Ser19-Thr20-Thr21Phe22-Pro23-Tyr24-Thr25-OHH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8OHH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8Ala9-OHH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-||Ala9-Gln10-Asn11-Ala12-Ile13-Ser14-Thr15-Thr16Phe17-Pro18-Tyr19-Thr20-OHH-Ala1-Gln2-Asn3-Ala4-Ile5-Ser6-Thr7-Thr8Phe9-Pro10-Tyr11-Thr12-OHH-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-OHH-Met1-Glu2-Val3-Val4-Gln5-||-Gln6-Thr7-Arg8Met9-Asp10-Lys11-Leu12-Thr13-||-Gln14-Gly15Arg16-Gln17-Thr18-Tyr19-Asp20-OHH-Leu1-Pro2-Val3-Gly4-Gly5-Asn6-Glu7-Lys8Lys9-Ala10-Lys11-Leu12-Ala13-Asn14-Val15Val16-Arg17-Lys18-Met19-Met20-OHH-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-OHH-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-Lys7-Lys8Ile9-Glu10-OHВыход%Чистота,(ВЭЖХ)52[M+H]+расcчитано[M+H]+найдено6422 *95.196.3575.24942781.4532575.25122781.46433298.6930.6023930.60382698.81001.63941001.63542897.52225.22162225.21272998.11313.63721313.6428773296.494.5548.23512427.1755548.23322427.18491497.22183.25152183.2597573795.795.2753.35261251.6692753.35521251.664612PB1(381-400)13PB1(391-400)1415PB1(395-400)PB1(411-420)1617PB1(525-530)PB1(525-535)18PB1(531-540)H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-||-Lys7-Lys8Ile9-Glu10-Lys11-Ile12-Arg13-Pro14-||-Leu15Leu16-Val17-Glu18-Gly19-Thr20-OHH-Lys1-Ile2-Arg3-Pro4-Leu5-Leu6-Val7-Glu8Gly9-Thr10-OHH-Leu1-Leu2-Val3-Glu4-Gly5-Thr6-OHH-Met1-Phe2-Asn3-Met4-Leu5-Ser6-Thr7-Val8Leu9-Gly10-OHH-Ile1-Gly2-Val3-Thr4-Val5-Ile6-OHH-Ile1-Gly2-Val3-Thr4-Val5-Ile6-Lys7-Asn8Asn9-Met10-Ile11-OHH-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp8Leu9-Gly10-OH1996.32358.35032358.35943396.51125.69901125.6948483796.994.9631.36611112.5479631.36301112.5447292795.394.7601.39191201.6973601.39011201.69294194.51132.54151132.5457Примечание: знаком || обозначены фрагменты для конвергентного синтеза.*выход приведен для пептида, синтезированного последовательным наращиванием пептидной цепи53Таблица 4.
Производные базовых пептидов 3 а-в, 4 а-г, 7 а-в, 14 а-в, 18 а-в№3а3б3в4а4бобозначенияпептидовPB1(6-13)PB1(6-14)4в4г7а7б7в14а14б14в18а18б18вPB1(26-30)PB1(395400)PB1(531540)[M+H]+расcчитано27153459Чистота,(ВЭЖХ)93.594.897.297.3929.6183972.6128971.62881000.6554929.6202972.6098971.62561000.65611993.61043.64991043.65282895.21042.66591042.66283094.31502.77521502.78053850347136693497.798.196.298.798.097.395.4547.2511590.2457589.2616630.3821673.3767672.39271131.5575547.2497590.2466589.2595630.3793673.3737672.39161131.55412993.51174.55211174.55532393.71173.56811173.5728аминокислотная последовательностьВыход%H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHAc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9NH2123Ac-Thr -Leu -Leu -Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8Ala9-OHAc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8Ala9-NH2FITC-Ahx1-Thr2-Leu3-Leu4-Phe5-Leu6-Lys7-Val8Pro9-Ala10-NH2H-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-NH2Ac-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-OHAc-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-NH2H-Leu1-Leu2-Val3-Glu4-Gly5-Thr6-NH2Ac-Leu1-Leu2-Val3-Glu4-Gly5-Thr6-OHAc-Leu1-Leu2-Val3-Glu4-Gly5-Thr6-NH2H-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp8Leu9-Gly10-NH2Ac-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp8Leu9-Gly10-OHAc-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp8Leu9-Gly10-NH254[M+H]+найдено3.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепиВсе представленные в таблице 1 пептиды, кроме PB1(111-130) и PB1(381400) были синтезированы последовательным наращиванием пептидной цепи поодной аминокислоте.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
