Диссертация (1150004), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Примерами подхода крупномасштабногоскрининга являются следующие методы:(1а) Систематический поиск крупных доменов, участвующих в белокбелковых взаимодействиях. Систематический поиск основан на точномкартировании сайта взаимодействия в пределах домена взаимодействия. Так, вчастности, был обнаружен пептидный фрагмент киназы 3 рецептора,сопряженного с G-белком. Данный пептид ингибировал взаимодействие киназыс соответствующим рецептором – ее субстратом – и, соответственно,блокировал десенситизацию, зависящую от работы этой киназы [67].(1б) Случайный поиск крупных доменов, участвующих в белок-белковыхвзаимодействиях.
Случайный поиск использует статистические библиотеки,состоящие из большого числа возможных пептидов определенной длины,19которые синтезируются или экспрессируются вирусом и проверяются набиологическую активность. Таким образом, например, был получен ингибиторвзаимодействия кальций-кальмодулин-зависимой киназы и кальмодулина. Приэтом найденные пептиды отличались по аминокислотной последовательностиот кальмодулин-связывающего участка киназы, и, соответственно, действоваликак мимитоп – то есть имитировали пространственную структуру участкасубстрата, имея при этом иную аминокислотную последовательность [68].(1в) Поиск ключевых аминокислотных остатков, участвующих в белокбелковых взаимодействиях. Осуществляется путем скрининга библиотеки,гдевопределенномположениипептидаимеютсяспецифическиеаминокислоты, например, фосфотирозин.Всевышеперечисленные методы былиуспешно примененыдляидентификации пептидов, модулирующих ББВ.
Однако эти методы требуютиспользования больших библиотек, до миллиардов пептидов, создание которыхсопряжено с большими трудозатратами. Кроме того, пептиды, обнаруженные спомощью этих методов, получили ограниченное применение в биологии [65].Помиморациональныеперечисленныхподходыдляметодовбылиидентификацииразработаныкороткихпростыепептидов(6-13аминокислотных остатков), ингибирующих ББВ. Эти пептиды использовалисьво многих лабораториях in vitro и in vivo для проверки на различныхбиологических видах, в том числе на человеке, что было описано в более чем250 публикациях.
При этом использовались несколько рациональных подходов.(IIa)Идентификацияобщихаминокислотныхпоследовательностейнегомологичных белков, взаимодействующих с общим белком-партнером:некоторые сигнальные белки взаимодействуют с несколькими в целомнегомологичными белковыми партнерами; короткие участки гомологии междуэтими белками могут представлять собой сайт связывания с ферментом.Пептиды, синтезированные на основе этих данных, могут регулировать ББВ и,следовательно, функцию фермента. Так, короткий участок гомологии междудвумя белками, связывающими протеинкиназу С, был использован для синтезапептида, который ингибировал действие β-протеинкиназы С in vivo [69].20(IIб)Идентификациягомологичныхдоменахконсервативныхнегомологичныхпоследовательностейвостальномвбелках.Консервативные последовательности в пределах гомологичных доменов вферментах, связанных с клеточными сигналами, могут быть критичными длякакой-либо определенной функции.
Одним из примеров является домен С2,присутствующий во многих белках. Пространственная структура несколькихС2-доменов имеет общую черту: бета-сэндвич, состоящий из четырехантипараллельных бета-участков. Было показано, что пептиды на основегомологичных последовательностей синаптотагмина и β-протеинкиназы Сявляются ингибиторами взаимодействия β-протеинкиназы С и белка RACK1 и,следовательно, дальнейшей передачи сигнала [65].В настоящее время помимо С2-домена известно несколько белковыхдоменов, функция которых главным образом или исключительно состоит всвязывании определенных последовательностей в других белках, в частности,SH2, SH3, PDZ и PTB [66].
Известны консенсусные аминокислотныепоследовательности в белках-пертнерах, узнаваемых этими доменами. Так,SH2-доменысвязываютсясаминокислотнымипоследовательностями,содержащими фосфотирозин; SH3-домены, как уже упоминалось, с пролинбогатыми аминокислотными последовательности. Стоит отметить, что часто,как в случае последних двух доменов, эпитоп белка, узнаваемого доменомсвязывания, является короткой аминокислотной последовательностью, насвязывание которой практически не влияет его пространственная структура.Эти так называемые «короткие линейные мотивы» (short linear motifs) являютсяособенно перспективными с точки зрения создания пептидных лекарств, как всилу небольшой длины, так и в силу независимости от пространственнойструктуры, которая может сильно различаться у свободного пептида и пептидав составе белковой молекулы [70, 71].Если известно, что несколько гомологичных белков с идентичнойфункцией связываются с одним и тем же белком-партнером (например,вирусные белки различных штаммов и один из клеточных белков), сравнениеихаминокислотнойпоследовательности21позволяетточноопределитьконсервативные аминокислотные остатки.
Если консервативные участкидостаточно протяженные, именно их аминокислотную последовательностьиспользуют для синтеза пептидов, способных быть антагонистами илисинергистами взаимодействия соответствующих полноразмерных белков [72].С другой стороны, если известно, что гомологичные белки связываются сразличными специфичными формами другого белка, например, выполняющегорегуляторные функции, то для того, чтобы повлиять на это взаимодействие,необходимо, напротив, искать участки наименьшей гомологии.
Именно этиучастки могут входить в состав сайта взаимодействия со специфическойформой белка-партнера, и пептид-фрагмент такого участка может ингибироватьвзаимодействие какой-либо конкретной пары изоформ белков, не влияя несвязывание в других парах [57].(IIв)Идентификациявнутримолекулярнымипоследовательностей,взаимодействиями.связанныхсВнутримолекулярныевзаимодействия в пределах различных ферментов удерживают их в неактивномсостоянии. Пептиды, соответствующие этим участкам, могут быть агонистами,поскольку они блокируют ингибиторное внутримолекулярное взаимодействие.Например,пептид-агонистβ-протеинкиназыСсоответствуетучасткугомологии из шести аминокислотных остатков между β-протеинкиназой С и ееRACK-белком – RACK1.
Эта последовательность была выбрана, в частности,потому, что в этих белках она отличается на один заряженный аминокислотныйостаток, делая возможным предположение о меньшем сродстве пептида из βпротеинкиназы С, чем пептида на основе последовательности в RACK1.И действительно, пептид на основе протеинкиназы С в опытах оказалсяагонистом, а пептид на основе RACK1 – антагонистом [58, 65].Вирус гриппа А имеет сегментированный РНК-геном, состоящий из 8минус-цепей РНК, кодирующих 16 белков [2, 73 - 75]: гемагглютинин (HA),нейраминидазу (NA), матричный белок 1 (М1), протонный канал М2, M42,нуклеопротеин (NP), неструктурный белок 1 (NS1), ядерный экспортный белок(NEP или NS2), белки PB1-F2, PB1-F3 (N40), PA-X, PA-N155, PA-N182, атакже три белка, составляющие РНК-полимеразу - PB1, PB2 и РА.22Индивидуальные антигенные свойства вирусам гриппа обеспечиваютповерхностныегликопротеины–гемагглютинининейраминидаза.Кнастоящему времени идентифицировано шестнадцать подтипов НА (Н1-Н16) идевять подтипов NA (N1-N9).
На их основе построена классификация вирусовгриппа А: H1N1, H3N2 и т.д.Жизненный цикл вируса гриппа включает в себя следующие стадии [3]:первичную адсорбцию вирусных частиц на мембране клеток, взаимодействие ссиаловым рецептором, рецептор-зависимый эндоцитоз, образование эндосомы,декапсидацию вируса в эндосоме, выход нуклеоида вируса в цитоплазму,транслокацию нуклеоида в клеточное ядро, транскрипционную активностьвирусного рибонуклеопротеина (РНП), репликацию вирусной РНК, транспортвирус-специфических РНК в цитоплазму инфицированных клеток, трансляциювирус-специфическихматричныхРНК(мРНК),подавлениесинтезаитрансляции клеточных мРНК вирусным белком NS1, накопление вирусспецифических белков, самосборку вирионов, почкование вирусных частиц иих освобождение от мембран инфицированных клеток.Несмотря на наличие в жизненном цикле вируса множества компонентов,представляющих потенциальную мишень для специфической химиотерапии, насегодняшний день немногие из них реализованы. В таблице 1 приведеныиспользуемые в клинической практике препараты для лечения гриппа, которыевоздействуют на вирусные белки [3, 76].Таблица 1.
Этиотропные препараты для терапии гриппапрепараттерапевтическая мишеньремантадинбелок М2амантадинзанамивирнейраминидазаосельтамивир232.3.1 Гемагглютинин (НА)Поверхностный гликопротеин НА присоединяет вирусную частицу ксиаловой кислоте рецепторов на поверхности клетки-хозяина и способствуетвысвобождению вирусных РНП-комплексов посредством мембранного слияния[77, 78]. НА представляет собой тример, разделенный на головную часть (headregion) и стволовую часть (stem region); каждая из цепей синтезируется какполипептид-предшественник, а затем расщепляется на два фрагмента – НА1 иНА2, соединённых дисульфидной связью. Фрагменты НА1 и НА2 содержат 328и221аминокислотныйостатоксоответственно.16подтиповНАфилогенетически делятся на две группы [79]: группу 1, состоящую из Н1, Н2,Н5, Н6, Н8, Н9, Н11, Н12, Н13 и Н16 подтипов; и группу 2, состоящую из Н3,Н4, Н7, Н10, Н14 и Н15 подтипов.Сайт связывания рецептора находится в головной части гемагглютинина,его окружают три структурных элемента НА1 в пределах каждого мономера,включая спираль-190 (остатки 188-194), петлю-130 (остатки 134-138) и петлю220 (остатки 221-228) [80-83].В результате компьютерного моделирования Нанди и соавторами [84]было обнаружено два соединения – потенциальных ингибитора гемаггютининаподтипа Н5:Вундерлих, Габриэль и Бойвин с соавторами [85-87] обнаружили, чтосвязывание трет-бутилгидрохинона с гемагглютинином ингибирует слияние смембраной, стабилизируя конформацию тримера в фазе, предшествующейслиянию, и предотвращает индуцируемые изменениями рН конформационныеизменения НА1, необходимые для мембранного слияния.Танг с соавторами [88] выявили селективный ингибитор для Н1-подтипагемагглютинина:24Использующийся в России для лечения и профилактики гриппа препаратарбидолобладает комплексным действием in vivo, и, возможно, препятствуетконформационным изменениям гемагглютинина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
