Диссертация (1150004), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Пептид РВ1 (1-25) был синтезирован двумя способами –указанным выше, а также конвергентно.Синтетические проблемы при “посадке” следующего аминокислотногоостатка или же деблокировании Fmoc-группы при синтезе всех обсуждаемыхпептидоввозникали,чащевсего,вреакцияхсгидрофобными,пространственно-затрудненными защищенными аминокислотами – Val, Leu,Ile, Asn, Gln, а также Lys, особенно, если таковые оказывались соседними ваминокислотной последовательности.Фрагмент 111-130 белка РВ1 (соединение 8) не удалось получитьпоследовательным наращиванием пептидной цепи - проблемы в синтезе былиотмечены при присоединении остатка глутамина в положении 6:Fmoc-Gln6(Trt)-OH+H2N-Thr7(t-Bu)-Arg8(Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lys11(Boc)-Leu12-Thr13(t-Bu)-Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)Asp20(O-tBu)DIC, HOBtFmoc-Gln (Trt)-Thr (t-Bu)-Arg (Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lys11(Boc)-Leu12678Thr13(t-Bu)-Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)-Asp20(OtBu)Реакцию не удавалось провести до конца.
Хроматограмма полученной послефинального деблокирования смеси продуктов содержала два пика, отвечающие,по данным масс-спектрометрии, пептидам 6-20 и 7-20 соответственно:H-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OHH-Gln-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OHЦелевоесоединениеудалосьполучитьконвергентнымметодомприиспользовании фрагментов 1-5, 6-13 и 14-20.ПептидPB1(271-290)(соединение9),синтезированныйпоследовательным наращиванием пептидной цепи, содержит два остатка55метионина в положениях 19 и 20. После финального деблокирования данногопептида на хроматограмме полученной смеси присутствовало 4 пика (рисунок19а).Рис.19ХроматограммыPB1(271-290)а)деблокированияРис.пептидапослефинальногоб)после20ХроматограммыPB1(525-535)а)деблокированияпослепептидафинальногоб)послевосстановления.восстановления.Мы предположили, что пики 1-3 соответствуют соединениям, содержащимокисленные формы остатков метионина (рисунок 21):Рис.
21 Окисленные формы остатков метионина.Действительно, восстановление данной смеси с помощью 1,2-этандитиола итриметилбромсилана в растворе трифторуксусной кислоты привело к целевомусоединению, соответствующему пику 4 (рисунок 19б).Аналогичная картина наблюдалась с пептидом PB1 (525-535) (соединение17), содержащим один остаток метионина в положении 10 – на рисунке 20представлены хроматограммы до (а) и после (б) его восстановления: пики 1 и 3соответствуют окисленной форме, а пик 2 - целевому соединению. Пику 4соответствует Fmoc-защищенный пептид, что подтверждается исчезновением56данной группы пиков (3 и 4) после обработки смеси водным растворомаммиака.Синтезфрагмента6-13белкаРВ1(соединение3)иегоN-ацетилированного производного (соединение 3б, таблица 2)H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHAc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHне представляет сложностей в условиях твердофазного синтеза.
Однако синтезв таких же условиях фрагмента 6-14 белка РВ1 и его N-ацетилированногопроизводного (соединения 4 и 4б),H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OHAc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OHотличающихся от фрагмента 6-13 остатком аланина в положении 9, приводит квозникновению проблем как с присоединением треонина-1, так и споследующим деблокированием Fmoc-группы. В данном случае эти проблемырешаются увеличением избытка реагентов на стадии присоединения Thr-1, атакже времени протекания реакции. Для деблокирования Fmoc-группы Thr-1 вслучае соединений 4 и 4б возникает необходимость в использовании болееэффективного реагента DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен).Амид фрагмента 6-13 (соединение 3а) был получен амидированием,котороепроводилосьсиспользованиемаммиачнойсолигидроксибензотриазола и диизопропилкарбодиимида:Boc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH1) DIC/NH4OBt2) TFA/TIS/H2OH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2Получить соединения 3в и 7в описанным выше способом не удалось –реакции не проходили до конца при увеличении как избытка реагентов, так ивремени протекания реакции.
Синтез соединения 3в также осложнялся плохойрастворимостью защищенного пептида:Ac-Thr1(t-Bu)-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH57Поэтому соединения 3в и 7в, а также соединения 4а, 4в, 4г, 7а, 14а, 14в,18а, 18в были синтезированы с использованием Ринк-амидной смолы,позволяющей получать соответствующие амиды на стадии отщепления отполимерного носителя. Получаемые таким образом амиды не содержатпримесей соответствующих кислот (как в случае проведения реакцииамидирования с помощью карбодиимида), что упрощает очистку целевыхсоединений.3.1.2 Конвергентный синтезКонвергентно были синтезированы пептиды PB1 (1-25), PB1 (111-130) иPB1 (381-400) (таблица 5).Таблица 5.
Конвергентный синтез пептидов№обозначенияпептидов2конденсациифрагментоврастворительизбытоккарбоксильнойкомпонентыHOBt(6-13) + (14-25)NMPPB1 (1-25)2.0HOBt(1-5) + (6-25)DMF812PB1(111-130)2.7HOAt(6-13) + (14-20)(1-5) + (6-20)(7-14) + (15-20)(1-6) + (7-20)PB1(381-400)реагентDMFDMFDMFDMF2.93.02.43.5HOAtHOAtHOAtНаличие в молекулах PB1 (1-25), PB1(381-400) остатков пролина вположениях 5, 13 (для PB1 (1-25)), 14 (для PB1(381-400)) открыло возможностидля использования в их синтезе фрагментных конденсаций с разбивкойаминокислотной последовательности по данной аминокислоте. Такой выборобусловлен весьма низкой способностью пролина подвергаться рацемизации.В случае пептида PB1(381-400) разбивку проводили также по аргинину вположении6.Вконденсацияхиспользовализащищенных фрагментов.582-3.5-кратныеизбыткиВслучаефрагмента1-25целевоесоединение,полученноесиспользованием конвергентного синтеза на хроматограмме совпадало стаковым, полученным последовательным наращиванием пептидной цепи.Лучшие результаты были получены в случае конвергентного синтеза.3.2 Противовирусная активность пептидовИспытания по противовирусной активности пептидов были проведенысотрудниками лаборатории молекулярных основ химиотерапии вирусныхинфекций НИИ Гриппа на культуре клеток MDCK, активность оценивали вотношении вируса гриппа (A/California/07/2009 (H1N1) pdm09), вызвавшегопандемию в 2009 году.
В экспериментах оценивали 50%-е цитотоксическую(CTD50) и эффективную (ED50) дозы, на основании которых рассчитывалииндекс селективности (SI). Считались активными препараты, имеющие SI >10.Первоначально были протестированы базовые соединения 1-18 (таблица6), для дальнейшей работы были выбраны наиболее активные. В качествепрепаратов сравнения были выбраны ремантадин, в отношении которогоисследуемый штамм обладает устойчивостью, а также осельтамивир, ккоторому он чувствителен.Таблица 6. Противовирусная активность базовых пептидов№1234567891011121314обозначенияпептидовPB1 (1-5)PB1 (1-25)PB1 (6-13)PB1 (6-14)PB1 (6-25)PB1 (14-25)PB1 (26-30)PB1(111-130)PB1(271-290)PB1(381-386)PB1(381-390)PB1(381-400)PB1(391-400)PB1(395-400)показатели активностиCTD50, мкг/млED50, мкг/мл745106100034010009510003410002871000500100063500140600721000500500500330547008010005759SI7.02.910.529.43.52.015.93.68.32.01.06.18.717.515161718PB1(411-420)PB1(525-530)PB1(525-535)PB1(531-540)ремантадиносельтамивир100010005001000препараты сравнения50300411500500582.42.01.017.2200.32.51000Как следует из приведенных в таблице 6 данных, синтезированныесоединения нетоксичны для клеток.
Наиболее активными в отношении вирусагриппа пептидами являются фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540белка РВ1 (соединения 3, 4, 7, 14, 18). Интересно отметить, что соединения 14 и18 не являются фрагментами N-концевой области белка РВ1, необходимой длясвязывания с белком РА.Индексы селективности фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения 3и 4) отличаются почти в три раза. Возможно, это связано с увеличениемколичества проникшего в клетки соединения 4 по сравнению с соединением 3за счет наличия в составе соединения 4 гидрофобного остатка аланина.
Крометого, остаток аланина в положении 14 белка РВ1 взаимодействует с остаткомглутамина-670 белка РА.Для увеличения стабильности и биодоступности наиболее активныхсоединений было решено синтезировать модифицированные пептиды –ацетилированные по N-концевой аминогруппе и амидированные по С-концевойкарбоксильнойгруппе.Данныемодификациипозволяютповыситьустойчивость пептидов к экзопептидазам и облегчить их проникновение черезклеточную мембрану.
Результаты тестирования представлены в таблице 7.Таблица 7. Противовирусная активность модифицированных пептидов№аминокислотная последовательность33а3б3вH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OHH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH2Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OHAc-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH260показатели активностиCTD50ED50SIмкг/мкг/млмл10009510.510003231.210003231.2>50011>4544а4б4в4г77а7б7в1414а14б14в1818а18б18вH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OHH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OHAc-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2FITC-Ahx-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-ProAla-NH2H-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-OHH-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-NH2Ac-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-OHAc-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-NH2H-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OHH-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-NH2Ac-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OHAc-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-NH2H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-OHH-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-NH2Ac-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-OHAc-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-NH2>500>5001000>500>500336854.55>15>8311.8>111>10010001000100050010005005005001000635556150575002005005815.918.217.93.317.51.02.51.017.210005020.010008312.010001287.8Как следует из таблицы, во всех случаях, кроме производных фрагмента395-400 (соединения 14, 14 а-в), амиды оказались более активными, чемсоответствующие кислоты, а введение N-концевой ацетильной группы в амидыпептидов привело к увеличению активности только в случае фрагментов 6-13 и6-14 белка РВ1 (соединения 3 и 4).
Наиболее активным из всехпротестированных соединений оказалось соединение 4в, имеющее SI >111.Для изучения механизма противовирусной активности этого соединения вследующей серии опытов были изучены его вирулицидные свойства(противовирусная активность вне клеток) и клеточная локализация.Эксперименты по вирулицидному действию соединений 4в и 4г показалиснижение титра вируса на 1.5 и 1 lgEID50 по сравнению с контролем, чтосвидетельствует об их слабом вирулицидном действии. Вероятно, данныймеханизм не является основным для этих соединений.Также был проведен эксперимент по изучению влияния соединения 4в наразличные стадии жизненного цикла вируса гриппа. Для этого препаратдобавляли в культуру клеток MDCK до, одновременно и в различные сроки61после заражения вирусом гриппа, после чего оценивали разницу в титрахвируса по сравнению с контролем (рисунок 23).Рис.
22 Оценка влияния времени добавления препарата на снижение титров вирусагриппа. После внесения вируса клетки инкубировали в течение часа при температуре4˚С. В этих условиях вирус связывается с клеточными рецепторами, но не проникаетвнутрь клетки. Все остальное время эксперимент проводили при 37˚С. Времяпроникновения вируса в клетку является точкой отсчета (обозначено как 0). Времяприсутствия соединения 4в в системе обозначено в часах относительно точки отсчета.Наибольшее снижение титра вируса было отмечено в эксперименте (-2) –10, то есть в том случае, когда препарат был добавлен за два часа допроникновения вируса в клетки и находился в системе в течение всего времениэксперимента.Крометого,снижениетитравирусанаблюдалосьвэкспериментах (-1) – 0 и 0 – 1, а также (-2) – (-1) и 0 – 2.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
