Диссертация (1150004), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Эти данные позволяютсделать вывод о том, что, вероятно, соединение 4в влияет на ранние стадиижизненного цикла вируса гриппа.Для изучения способности соединения 4в к проникновению в клетки вамид соответствующего пептида была введена флуоресцентная метка спомощьюфлуоресцеин-5-изотиоцианата,62линкеромвыступала6-аминогексановая кислота. Введение флуоресцентной метки практически неотразилось на противовирусной активности изучаемого препарата (4г, таблица7) что свидетельствует о сходстве механизмов действия соединений 4в и 4г.Исследование локализации флуоресцентно-меченого соединения 4г вклетках MDCK с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентноймикроскопии позволило сделать вывод о том, что исследуемое соединениепроникаетчерезклеточнуюмембрану.Спомощьюпроточнойцитофлуориметрии было показано, что данный пептид способен к связываниюс живыми клетками MDCK.
Изучение окрашенных клеток с помощьюфлуоресцентной микроскопии показало, что окрашивание происходит за счётпроникновения соединения 4г сквозь мембрану клетки.Вероятно,противовируснаяактивностьсоединения4в–N-ацетилированного амида фрагмента 6-14 белка РВ1 реализуется путемнарушения сборки комплекса РНК-полимеразы либо за счет связыванияпептида 4в с белком РА, либо за счет стабилизации β-структурированногосостояния N-концевой части белка РВ1.Данное соединение, на наш взгляд, является перспективной основой длясоздания лекарственных препаратов для профилактики и лечения гриппа А.634. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ4.1. Материалы и методы исследованияCинтез и очистка пептидов [44, 191].
Синтез пептидов проводилитвердофазным методом на 2-хлортритилхлоридной (2-Chlorotrityl chloride resin,100-200 mesh, емкость смолы 1,0-1,6 ммоль/г) и Ринк-амидной (Fmoc-Rinkamide AM polystyrene resin, 100-200 mesh, емкость смолы 0,40-0,74 ммоль/г)смолах по Fmoc-/t-Bu стратегии с использованием как стандартных методикпоследовательного наращивания цепи, так и конвергентного подхода. В работеиспользовали реактивы фирмы Iris Biotech (Германия) чистотой не менее 98 %.В реакциях последовательного наращивания пептидной цепи в качествеконденсирующих агентов использовали N, N’-диизопропилкарбодиимид (DIC)и 1-гидрокси-бензотриазол (HOBt) (20% мольные избытки относительноактивируемых аминокислот), реакции проводили в диметилформамиде (DMF).В реакциях использовали 2х-5 кратные избытки защищенных аминокислот.
Дляфрагментных конденсаций наряду с указанными реагентами использовалисьтакже 1-гидрокси-7-аза-бензотриазол (HOAt) и N-метилпирролидон (NMP).Полноту протекания реакций оценивали с помощью нингидриновоготеста Кайзера на свободные аминогруппы [192]. В случае завершения реакции(отрицательный тест Кайзера) для последующих операций смолу промывали 68 раз DMF от компонентов реакционного раствора.
В случае положительноготеста реакцию повторяли, увеличивая избыток реагентов и время протеканияреакций.Длявременнойзащитыфлуоренилметилоксикарбонильнаяα-аминогрупп(Fmoc)–группа,использоваласьудаление9-которойпроводили 2х-3х кратной обработкой смолы 20 % раствором диэтиламина вдиметилформамиде в течение 5 – 20 минут. В некоторых случаях смолуобрабатывали смесью DMF : диэтиламин : DBU (1,8-диазабицикло[5.4.0]ундец7-ен) в объемном соотношении 48:1:1 в течение 10 минут. Для удаленияостаточных количеств диэтиламина или DBU смолу промывали 6-8 раз DMF.64В случае неполного деблокирования Fmoc-группы после отщепленияцелевого соединения от полимерного носителя пептид выдерживали приперемешивании в концентрированном водном растворе аммиака в течение часа,после чего раствор концентрировали на ротационном испарителе и подвергалилиофилизации.Вкачествепостоянныхзащитныхгрупписпользовались:трет-бултилоксикарбонильная (BOC) – для ε-аминогруппы лизина, 2,2,4,6,7пентаметилдигидробензофуран-5-сульфонильная (Pbf) – для гуанидиновойгруппы аргинина, трифенилметильная (Trt) – для амидных групп глутамина иаспарагина, трет-бутильная (tBu) – для ОН-групп треонина, тирозина и серина,(О-tBu) для β- и γ- карбоксильных групп аспарагиновой и глутаминовой кислот.Защищенныеследующимфрагментыобразом:длядляконвергентногоудаленияDMFсмолусинтезаполучалидваждыпромывалидихлорметаном (DCM), 10-15 раз по 1,5-2 минуты обрабатывали 1% растворомтрифторуксусной кислоты (TFA) в DCM; полученные растворы объединяли вколбе, содержащей 10% раствор пиридина в метаноле, смесь концентрировалинаротационномиспарителе.Костаткудобавляливоду,осадокотфильтровывали.
Чистота полученных в указанных условиях защищенныхпептидных фрагментов по данным ВЭЖХ составила более 95%.Дляфинальногоотщепления его отдеблокированияцелевогосоединения,атакжеполимерного носителя, смолу в течение двух часовобрабатывали раствором TFA, содержащим воду и триизопропилсилан (TIS) вследующихобъемныхсоотношениях95:2,5:2,5[44].Вслучаеметионинсодержащих пептидов использовали раствор TFA, содержащий воду,триизопропилсилан (TIS) и 1,2-этандитиол (EDT) в следующих объемныхсоотношениях 92,5:2,5:2,5:2,5.Полученный раствор концентрировали наротационном испарителе. После добавления к остатку метилтретбутилового(MTBE) или диэтилового эфиров продукт отфильтровывали. Полнотудеблокирования боковых функциональных групп контролировали с помощьюаналитической обращеннофазной ВЭЖХ, при необходимости указаннуюпроцедуру повторяли.65Восстановление метионинсодержащих пептидов проводили по методу,описанному в [44]: к раствору пептида в TFA добавляли EDT итриметилбромсилан (TMSBr) в количестве 15,7 и 13 мкл/мл соответственно,раствор выдерживали 15-30 минут при перемешивании, далее концентрировалии выделяли продукт с использованием MTBE, как описано выше.В случае Ринк-амидной смолы перед финальным деблокированием смолупромывали 50 % раствором уксусной кислоты в дихлорметане (2х10 мл) втечение 5 и 10 минут соответственно.
Условия финального деблокированиясовпадают с таковыми для 2-хлортритилхлоридной смолы.Очистку полученных пептидов проводили методом препаративнойобращеннофазной ВЭЖХ в градиентном режиме в системе ацетонитрил-водаTFA. Фракции, содержащие целевой компонент, после объединения иконцентрирования в вакууме подвергались лиофилизации на приборе Chris Alfa1-2 LD plus.Аналитическую жидкостную хроматографию проводили на хроматографеShimadzu LC-20AD, препаративную - на хроматографе KNAUER Preparativepump K-1800.
Указанные приборы оснащены спектрофотометрическимидетекторами. Анализ проводили при длине волны 214 нм.При проведении аналитической ВЭЖХ использовали колонку WatersSymmetry, C-18, 3.5 мкм, 2.1×150 мм при скорости потока элюента 0.3 мл/мин.Для градиентного элюирования использовали следующие системы: фаза А 0.1 TFA, фаза Б - 0.1 TFA в ацетонитриле (осч сорт 0, “Криохром”, СПб).Метод 1: изменение концентрации фазы Б в А от 0 до 97 за 15 минут прискорости потока элюента 0.3 мл/мин; метод 2: изменение концентрации фазы Бв А от 0 до 97 за 15 минут при скорости потока элюента 0.4 мл/мин. Припроведении препаративной ВЭЖХ использовали колонку Waters X Bridge C18,10мкм, 127 Å, 50×250 мм при скорости потока элюента 50 мл/мин.Масс-спектрырегистрировалинаприбореBrukermicrоTOF,оборудованном ионным источником типа электроспрей (ESI).
Разрешениеприбора составляло 10000 на полувысоте пика. Для проведения масс66спектрометрических исследований образцы растворялись в воде, метаноле,ацетонитриле или дихлорметане. Верхняя граница концентрации растворасоставляла ~5 ÷ 15 мкг/мл. Полученный раствор подавался в капилляр спомощью шприцевого насоса KDScientific. Напряжение, создаваемое наконечном электроде, и напряжение на капилляре составляли −500 В и −4500 В(ESI+-MS), при потоке раствора образца через капилляр 3 мкл/мин. Напряжениена выходе капилляра составляло ±70 или ±150 В.
Масс-спектры регистрировалив диапазоне m/z от 50 до 3000.Испытанияпопротивовируснойактивностипептидов,атакжекомпьютерное моделирование их структуры было проведено сотрудникамиНИИ Гриппа Минзравсоцразвития РФ (СПб). Проточная цитофлуориметрияпроводилась в НИИ Экспериментальной Медицины СЗО РАМН (СПб).Вирусыиклетки.ВработеиспользоваливирусгриппаA/California/07/09 (H1N1)pdm09. Вирус пассировали в аллантоисной полости10-12 дневных куриных эмбрионов в течение 48 часов при 36°С. Дляэкспериментов на клеточных культурах использовали культуру клеток MDCK(клетки почки собаки) (ATCC CCL-34), выращенные на 96 луночных панеляхна среде Альфа-МЕМ в присутствии 10 % сыворотки плода коровы.Титрованиевируса.Изисходноговируссодержащегоматериалаготовили серию 10-кратных разведений (10-1 – 10-7) на среде МЕМ.
В лунки 96луночного планшета добавляли по 100 мкл разведений вируса и оставляли надвое суток при 36˚С и 5% CO2. Через 48 часов из лунок отбирали по 100 мклкультуральной жидкости и вносили в планшет для иммунологических реакций,затем проводили реакцию гемагглютинации (РГА). Для этого в лунки сотобранной культуральной жидкостью добавляли равное количество 1%суспензии куриных эритроцитов в физиологическом растворе. Результатыучитывали через 30 минут инкубации при комнатной температуре. Заинфекционный титр вируса принимали наибольшее разведение вируса,вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов. Титр выражали в десятичныхлогарифмах 50% экспериментальной инфекционной дозы (lg EID50).67Исследование токсичности пептидов in vitrо.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
