Диссертация (1150004), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Защищенный фрагмент 14-25 (таблица 11) не подвергалидеблокированию с полимерного носителя.Синтез защищенного фрагмента 1-5Fmoc-Met-Asp(O-tBu)-Val-Asn(Trt)-Pro-ОНТаблица 9. Синтез защищенного фрагмента 1-5№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAМ,г/моль129.273ν, ммольm, г/ V, млt, ч1.556.210.8/1.0222345FmocProOHFmocAsn(Trt)OHDICHOBt*H2OFmocValOHFmocAsp(O-tBu)OHFmocMetOH337.4596.7126.2153.1339.4411.5371.5122.42.42220.341.190.3/0.370.370.680.820.742322Получено 746 мг (68%).Синтез защищенного фрагмента 6-13Fmoc-Thr(t-Bu)-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys(Boc)-Val-Pro-ОНТаблица 10. Синтез защищенного фрагмента 6-13№12345678реагенты2-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocProOHFmocValOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHFmocThr(t-Bu)OHМ, г/мольν, ммоль2.5910.35244.84.8444444129.2337.4339.4126.2153.1468.5353.4387.4353.4353.4397.4m, г/ V, мл1.671.34/1.70.681.360.61/0.750.741.871.411.71.411.411.59t, ч2321.52151724Получено 1.47 г (59%).Синтез защищенного фрагмента 14-25 H-Ala-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Ala-Ile-Ser(tBu)-Thr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Phe-Pro-Tyr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-OHТаблица 11.
Синтез защищенного фрагмента 14-25№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocThr(t-Bu)OHFmocTyr(t-Bu)OHDICHOBt*H2OFmocProOHFmocPheOHFmocThr(t-Bu)OH2345М,г/моль129.2397.4459.6126.2153.1337.4387.4397.474ν, ммольm, г/ V, млt, ч1.556.21.12.22.642.642.22.22.210.8/1.020.4371.010.33/0.40.40.740.850.87222226789101112FmocThr(t-Bu)OHFmocSer(t-Bu)OHFmocIleOHFmocAlaOH*H2OFmocAsn(Trt)OHFmocGln(Trt)OHFmocAlaOH*H2O397.4383.4353.4313.3596.7610.7313.32.22.22.22.22.22.22.20.870.840.780.691.311.340.69225751614После деблокирования Fmoc-группы смола была промыта дихлорметаном(4х10мл), высушена в вакууме и разделена на 2 части, соответствующие 0.5 и0.6 ммоль пептида.
Часть пептидил-полимера, соответствующую 0.5 ммольпептида, использовали для синтеза защищенного фрагмента 6-25.Синтез защищенного фрагмента 6-25 конденсацией фрагментов 6-13 и 14-25H-Thr(t-Bu)-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys(Boc)-Val-Pro-Ala-Gln(Trt)-Asn(Trt)-Ala-IleSer(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Phe-Pro-Tyr(t-Bu)-Thr(t-Bu)-OHК смоле, содержащей 0.5 ммоль фрагмента 14-25 был добавленпредварительно охлажденный раствор 1.25 г (1 ммоль) защищенного фрагмента6-13, 0.31 г (2 ммоль) HOBt и 0.31 мл (2 ммоль) DIC в 30 мл NMP.
Реакционнуюсмесь перемешивали в течение 13 суток. Контроль за ходом реакцииосуществляли каждые 3 суток с помощью теста Кайзера на свободныеаминогруппы, каждый раз добавляя в реакционную смесь 0.22 мл (1.4 ммоль)DIC. После завершения реакции смола была отфильтрована и промыта 3х10 млNMP и 5х10 мл DMF, деблокирование Fmoc-группы осуществляли описаннымранее способом. Полученный фрагмент 6-25, не выделяя, использовали длядальнейших реакций.Получение целевого соединения - конденсация фрагментов 6-25 и 1-5К смоле, содержащей 0.25 ммоль фрагмента 6-25 был добавленпредварительно охлажденный раствор 746 мг (0.666 ммоль) защищенногофрагмента 1-5, 205 мг (1.33 ммоль) HOBt и 208 мкл (1.33 ммоль) DIC в 3.5 млDMF.
Реакционную смесь перемешивали в течение 21 часа. После завершенияреакции смола была отфильтрована и промыта 7х10 мл DMF. Контроль за75ходом реакции, деблокирование Fmoc-группы, а также стадию финальногодеблокирования осуществляли описанным ранее способом.Получено:518мг(75%).Послеочисткипептидаспомощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 188 мг (общийвыход 27 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 97.9%.
HRMS (ESI+), m/z: 2781.4643 ([М+Н]+), рассчитано 2781.4532.Синтез фрагмента 14-25 белка РВ1H-Ala1-Gln2-Asn3-Ala4-Ile5-Ser6-Thr7-Thr8-Phe9-Pro10-Tyr11-Thr12-OHФинальное деблокирование пептидил-полимера, содержащего 0.6 ммользащищенногофрагмента14-25белкаРВ1сосвободнойN-концевойаминогруппой (данные по синтезу приведены в таблице 11) проводилиописанным ранее способом.
Получено: 478 мг (61 %). После очистки целевогосоединения с помощью препаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизацииполучено 231 мг (общий выход 29 %), чистота продукта по данныманалитической ВЭЖХ составила 98.1 %. HRMS (ESI+), m/z: 1313.6428 ([М+Н]+),1313.6372 рассчитано.Синтез фрагмента 6-25 белка РВ1H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-Gln10-Asn11-Ala12-Ile13-Ser14Thr15-Thr16-Phe17-Pro18-Tyr19-Thr20-OHФинальное деблокирование пептидил-полимера, содержащего 0.25 ммользащищенногофрагмента6-25белкаРВ1сосвободнойN-концевойаминогруппой (синтез описан на стр.
75) проводили описанным ранееспособом. Получено: 435 мг (78 %). После очистки целевого соединения спомощью препаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 155мг (общий выход 28 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХсоставила 97.5 %. HRMS (ESI+), m/z: 2225.2127 ([М+Н]+), 2225.2216 рассчитано.Синтез фрагмента 1-5 белка РВ1H-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-ОНЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице12.76Таблица 12. Синтез фрагмента 1-5 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocProOHFmocAsn(Trt)OHDICHOBt*H2OFmocValOHFmocAsp(O-tBu)OHFmocMetOH2345М,г/мольν, ммоль0.7753.10.61.21.441.441.21.21.2129.2337.4596.7126.2153.1339.4411.5371.5m, мг/ V,мкл500401/512202716182/225220407494446t, ч32322Получено: 260 мг (76%).
После очистки целевого соединения с помощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 221 мг (общийвыход 64 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила95.1 %. HRMS (ESI+), m/z: 575.2512 ([М+Н]+), 575.2494 рассчитано.Синтез фрагмента 6-13 белка РВ1H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 13.Таблица 13. Синтез фрагмента 6-13 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocProOHFmocValOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHFmocThr(t-Bu)OH2345678М, г/мольν, ммоль129.2337.4339.4126.2153.1468.5353.4387.4353.4353.4397.40.7753.10.350.70.840.840.70.70.70.70.70.7m, мг/ V,мкл500401/512118238106/131129328247271247247278t, ч2321.52151724Получено: 254 мг (78 %). После очистки целевого соединения с помощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 103 мг (общий77выход 32 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила98.6 %.
HRMS (ESI+), m/z: 930.6038 ([М+Н]+), 930.6023 рассчитано.Синтез N-ацетилированного фрагмента 6-13 белка РВ1Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 14.Таблица 14. Синтез N-ацетилированного фрагмента 6-13 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocProOHFmocValOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHFmocThr(t-Bu)OHDIPEAAc2O23456789М, г/мольν, ммоль129.2337.4339.4126.2153.1468.5353.4387.4353.4353.4397.4129.2102.10.7753.10.450.91.081.080.90.90.90.90.90.91.81.8m, мг/ V,мкл500401/512152305136/170165422318349318318358233/300184/170t, ч232.5142.5317241.5Получено: 319 мг (73 %).
После очистки целевого соединения с помощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 65 мг (общийвыход 15 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила94.8 %. HRMS (ESI+), m/z: 972.6128 ([М+Н]+), 972.6098 рассчитано.Синтез амида фрагмента 6-13 белка РВ1H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2Целевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 15.Таблица 15.
Синтез защищенного фрагмента 6-13 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAМ, г/мольν, ммоль129.20.7753.178m, мг/ V,мкл500401/512t, ч22345678FmocProOHFmocValOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHBocThrOH337.4339.4126.2153.1468.5353.4387.4353.4353.4219.20.450.91.081.080.90.90.90.90.90.9152305136/1701654223183493183181972.52231553Пептид, содержащий защитные группы, был отщеплен от полимерногоносителя по методике, описанной ранее.
Получено 260 мг (51 %). Реакциюамидирования проводили по следующей схеме:Boc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH1) DIC/NH4OBt2) TFA/TIS/H2OH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2К раствору 260 мг (0.23 ммоль) защищенного фрагмента 6-13 белка РВ1 в20 мл тетрагидрофурана и 5 мл воды при перемешивании было добавлено 105мг (0.69 ммоль) аммиачной соли 1-гидроксибензотриазола (NH4OBt) и 47 мкл(0.3 ммоль) DIC. Через 17 часов в реакционную смесь было добавлено 35 мг(0.23 ммоль) NH4OBt и 60 мкл (0.38 ммоль) DIC, перемешивание продолжали втечение 48 часов, контроль за ходом реакции осуществляли с помощьюаналитической ВЭЖХ.
Спустя указанное время реакционная смесь былаупарена досуха, финальное деблокирование проводили, как было описаноранее. После очистки целевого соединения с помощью препаративной ВЭЖХ ипоследующей лиофилизации получено 115 мг (общий выход 27 %), чистотапродукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 93.5 %.
HRMS (ESI+),m/z: 929.6202 ([М+Н]+), 929.6183 рассчитано.Синтез N-ацетилированного амида фрагмента 6-13 белка РВ1Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH2Целевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 16.79Таблица 16. Синтез N-ацетилированного амида фрагмента 6-13 белка РВ1№реагенты1Fmoc-Rinkамидная смолаDCM20% Et2NH/DMFFmocProOHDICHOBt*H2ODIPEAAc2OFmocValOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHFmocThr(t-Bu)OHDIPEAAc2O23456789101112М, г/мольν, ммольm, мг/ V,мкл7000.4510 мл2х10 мл; 5 и 20 мин2.257592.7341/4212.74141.8233/2971.8184/1700.93051.08136/1701.081650.94220.93180.93490.93180.93180.93581.8233/3001.8184/170337.4126.2153.1129.2102.1339.4126.2153.1468.5353.4387.4353.4353.4397.4129.2102.1t, ч13.51.532142.551632Получено: 400 мг (91 %).
После очистки целевого соединения с помощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 148 мг (общийвыход 34 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила97.2 %. HRMS (ESI+), m/z: 971.6256 ([М+Н]+), 971.6288 рассчитано.Синтез фрагмента 6-14 белка РВ1H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OHЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 17.Таблица 17. Синтез фрагмента 6-14 белка РВ1№1234реагенты2-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocAlaOH*H2OFmocProOHDICHOBt*H2OFmocValOHFmocLys(Boc)OHМ, г/мольν, ммоль1.866.21.22.42.882.882.42.4129.2313.3337.4126.2153.1339.4468.580m, г/ V, мл1.20.96/1.230.380.810.36/0.450.440.811.12t, ч233256789FmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHDICHOBt*H2OFmocThr(t-Bu)OH353.4387.4353.4353.4126.2153.1397.42.42.42.43.64.324.323.60.850.930.851.270.55/0.670.661.43231435;3Для деблокирования Fmoc-группы с остатка треонина в положении 1наряду с диэтиламином использовали DBU, как было описано ранее.
Послеэтого смола была промыта дихлорметаном (4х10мл), высушена в вакууме иразделена на 2 равные части. Одну часть использовали для финальногодеблокирования, вторую - для получения ацетилированного производного,синтез которого описан ниже. Получено: 457 мг (76 %). После очистки целевогосоединения с помощью препаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизацииполучено 154 мг (общий выход 26 %), чистота продукта по данныманалитической ВЭЖХ составила98.8 %. HRMS (ESI+), m/z: 1001.6354([М+Н]+), 1001.6394 рассчитано.Синтез N-ацетилированного фрагмента 6-14 белка РВ1Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OHСмолу, содержащую 0.6 ммоль защищенного фрагмента 6-14 белка РВ1со свободной N-концевой аминогруппой (данные по синтезу приведены втаблице 17) перемешивали в течение 1 часа в растворе 0.4 мл (2.4 ммоль)DIPEA и 0.23 мл (2.4 ммоль) ангидрида уксусной кислоты в 10 мл DMF, послечего смола была отфильтрована и промыта DMF (7х10мл).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
