Диссертация (1150004), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Финальноедеблокирование проводили, как было описано ранее. Получено: 419 мг (67 %).После очистки целевого соединения с помощью препаративной ВЭЖХ ипоследующей лиофилизации получено 120 мг (общий выход 19 %), чистотапродукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 93.6 %. HRMS (ESI+),m/z: 1043.6528 ([М+Н]+), 1043.6499 рассчитано.Синтез 6-(9-флуоренилметилоксикарбонил)аминогексановой кислоты(FmocAhxOH)2.62 г (0.02 моль) 6-аминогексановой кислоты растворили в 17 мл воды вприсутствии 0.76 г (0.019 моль) гидроксида натрия. К данному раствору при81перемешивании одной порцией была добавлена суспензия 6.48 г (0.0192 моль)FmocOSu в 17 мл тетрагидрофурана. Реакционную смесь перемешивали втечение 1 часа, поддерживая рН = 8 добавлением триэтиламина, после чегореакционную смесь сконцентрировали с помощью ротационного испарителя идобавили одной порцией в 100 мл 1.5N раствора соляной кислоты.
Выпавшийосадок был отфильтрован и промыт на фильтре водой (4х по 10 мл), после чеговысушен и перекристаллизован из 60 % этанола. Получено 4.71 г (67 %). Поданным аналитической ВЭЖХ, параметры удерживания полученного веществасовпадают с таковыми для имеющегося стандарта целевого соединения.Синтез амида фрагмента 6-14 белка РВ1H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-NH2Целевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 18.Таблица 18.
Синтез амида фрагмента 6-14 белка РВ1№1234567891011реагентыFmoc-Rinkамидная смолаDCM20% Et2NH/DMFFmocProOHDICHOBt*H2ODIPEAAc2OFmocValOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOHDICHOBt*H2OFmocThr(t-Bu)OHМ, г/мольν, ммоль1.1m, г/ V, мл1.7210 мл2х10 мл; 5 и 20 мин4.41.485.280.67/0.825.280.814.40.57/0.734.40.45/0.422.20.752.640.33/0.412.640.42.20.1032.20.782.20.852.20.783.31.173.960.5/0.623.960.613.31.31337.4126.2153.1129.2102.1339.4126.2153.1468.5353.4387.4353.4353.4126.2153.1397.4t, ч131.52232.55416Начиная с остатка лейцина в положении 2 для деблокирования Fmocгруппы смолу промывали 3 раза 20% раствором диэтиламина в DMF (5, 20 и 1082мин). В случае остатка треонина в положении 1 наряду с диэтиламиномиспользовали DBU, как было описано ранее.После деблокирования Fmoc-группы смола была промыта дихлорметаном(4х10мл), высушена в вакууме и разделена на 3 части, соответствующие 0.45,0.45 и 0.2 ммоль пептида.
Часть пептидил-полимера, соответствующую 0.45ммоль пептида, использовали для финального деблокирования. Получено: 425мг (94 %). После очистки целевого соединения с помощью препаративнойВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 264 мг (общий выход 59 %),чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 97.3 %. HRMS(ESI+), m/z: 1000.6561 ([М+Н]+), 1000.6554 рассчитано.Синтез N-ацетилированного амида фрагмента 6-14 белка РВ1Ac-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-NH2Смолу, содержащую 0.45 ммоль защищенного фрагмента 6-14 белка РВ1со свободной N-концевой аминогруппой (данные по синтезу приведены втаблице 18) перемешивали в течение 1 часа в растворе 0.3 мл (1.8 ммоль)DIPEA и 0.17 мл (1.8 ммоль) ангидрида уксусной кислоты в 10 мл DMF, послечего смола была отфильтрована и промыта DMF (7х10мл).
Финальноедеблокирование проводили, как было описано ранее. Получено: 420 мг (89 %).После очистки целевого соединения с помощью препаративной ВЭЖХ ипоследующей лиофилизации получено 137 мг (общий выход 28 %), чистотапродукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 95.2 %. HRMS (ESI+),m/z: 1042.6628 ([М+Н]+), 1042.6659 рассчитано.Синтез флуоресцеин-меченого амида фрагмента 6-14 белка РВ1FITC-Ahx1-Thr2-Leu3-Leu4-Phe5-Leu6-Lys7-Val8-Pro9-Ala10-NH2Смолу, содержащую 0.2 ммоль защищенного фрагмента 6-14 белка РВ1со свободной N-концевой аминогруппой (данные по синтезу приведены втаблице 18) перемешивали в течение 15 часов в растворе 0.35 г (1 ммоль) FmocAhx-ОН, 0.18 г (1.2 ммоль) HOBt и 0.19 мл (1.2 ммоль) DIC в 5 мл DMF, послечего смолу отфильтровали и промыли DMF (7х10мл).
После деблокированиеFmoc-группы, проведенного описанным ранее способом, к смоле был добавлен83раствор 0.117 г (0.3 ммоль) флуоресцеин-5-изотиоцианата (FITC) в 4 мл смесипиридина, диметилформамида и дихлорметана в соотношении 12:7:5, реакциюпроводили при перемешивании в течение 24 часов, после чего смолуотфильтровали и промыли DMF (7х10мл).
Финальное деблокированиепроводили описанным ранее способом. Получено: 266 мг (88 %). После очисткицелевого соединения с помощью препаративной ВЭЖХ и последующейлиофилизации получено 91 мг (общий выход 30 %), чистота продукта поданным аналитической ВЭЖХ составила 94.3 %. HRMS (ESI+), m/z: 1502.7805([М+Н]+), 1502.7752 рассчитано.Синтез фрагмента 26-30 белка РВ1H-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-OHЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 19.Таблица 19.
Синтез фрагмента 26-30 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocTyr(t-Bu)OHFmocProOHDICHOBt*H2OFmocProOHFmocAsp(O-tBu)OHFmocGlyOH2345М, г/мольν, ммольt, ч129.2459.6337.4126.2153.1337.4411.52.329.31.83.64.324.323.63.6m, г/ V,мл1.51.2/1.540.831.210.55/0.670.661.211.48297.43.61.072222.53После деблокирования Fmoc-группы смола была промыта дихлорметаном(4х10мл), высушена в вакууме и разделена на 2 равные части. Одну частьиспользовали для финального деблокирования, вторую - для полученияацетилированного производного, синтез которого описан ниже.
Получено: 420мг (85 %). После очистки целевого соединения с помощью препаративнойВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 380 мг (общий выход 77 %),чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 96.4 %. HRMS(ESI+), m/z: 548.2332 ([М+Н]+), 548.2351 рассчитано.84Синтез N-ацетилированного фрагмента 26-30 белка РВ1Ac-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-OHСмолу, содержащую 0.9 ммоль защищенного фрагмента 26-30 белка РВ1со свободной N-концевой аминогруппой (данные по синтезу приведены втаблице 19) перемешивали в течение 1 часа в растворе 0.6 мл (3.6 ммоль)DIPEA и 0.34 мл (3.6 ммоль) ангидрида уксусной кислоты в 10 мл DMF, послечего смола была отфильтрована и промыта DMF (7х10мл). Финальноедеблокирование проводили, как было описано ранее.
Получено: 360 мг (68 %).После очистки целевого соединения с помощью препаративной ВЭЖХ ипоследующей лиофилизации получено 263 мг (общий выход 50 %), чистотапродукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 98.1 %. HRMS (ESI+),m/z: 590.2466 ([М+Н]+), 590.2457 рассчитано.Синтез амида фрагмента 26-30 белка РВ1H-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-NH2Целевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 20.Таблица 20.
Синтез амида фрагмента 26-30 белка РВ1№реагенты1Fmoc-Rink-амиднаясмолаDCM20% Et2NH/DMFFmocTyr(t-Bu)OHDICHOBt*H2ODIPEAAc2OFmocProOHDICHOBt*H2OFmocProOHFmocAsp(O-t-Bu)OHFmocGlyOH2345678М,г/мольν, ммоль1.48459.6126.2153.1129.2102.1337.4126.2153.1337.4411.5297.4m, г/ V,мл2.3110 мл2х10 мл; 5 и 20 мин5.922.727.10.9/1.17.11.095.920.76/0.985.920.6/0.562.961.003.550.45/0.553.550.542.961.002.961.222.960.88t, ч121232.52После деблокирования Fmoc-группы смола была промыта дихлорметаном(4х10мл), высушена в вакууме и разделена на 2 равные части. Одну часть85использовали для финального деблокирования, вторую - для полученияацетилированного производного, синтез которого описан ниже. Получено: 380мг (94 %).
После очистки целевого соединения с помощью препаративнойВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 154 мг (общий выход 38 %),чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 97.7 %. HRMS(ESI+), m/z: 547.2497 ([М+Н]+), 547.2511 рассчитано.Синтез N-ацетилированного амида фрагмента 26-30 белка РВ1Ac-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-NH2Смолу, содержащую 0.74 ммоль защищенного фрагмента 26-30 белка РВ1со свободной N-концевой аминогруппой (данные по синтезу приведены втаблице 20) перемешивали в течение 1 часа в растворе 0.49 мл (2.96 ммоль)DIPEA и 0.28 мл (2.96 ммоль) ангидрида уксусной кислоты в 10 мл DMF, послечего смола была отфильтрована и промыта DMF (7х10мл). Финальноедеблокирование проводили, как было описано ранее.
Получено: 401 мг (92 %).После очистки целевого соединения с помощью препаративной ВЭЖХ ипоследующей лиофилизации получено 148 мг (общий выход 34 %), чистотапродукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 96.2 %. HRMS (ESI+),m/z: 589.2595 ([М+Н]+), 589.2616 рассчитано.Синтез фрагмента 111-130 белка РВ1 последовательным наращиваниемпептидной цепиH-Met1-Glu2-Val3-Val4-Gln5-Gln6-Thr7-Arg8-Met9-Asp10-Lys11-Leu12-Thr13-Gln14Gly15-Arg16-Gln17-Thr18-Tyr19-Asp20-OHСинтез проводили по описанной ранее общей методике, количествореагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 21.Таблица 21.
Синтез фрагмента 111-130 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocAsp(O-tBu)OHFmocTyr(t-Bu)OH2М,г/мольν, ммольt, ч129.2411.50.7753.10.35m, мг/V,мкл500401/512144459.60.732228623456789101112131415DICHOBt*H2OFmocThr(t-Bu)OHFmocGln(Trt)OHFmocArg(Pbf)OHFmocGlyOHFmocGln(Trt)OHFmocThr(t-Bu)OHFmocLeuOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocAsp(O-tBu)OHFmocMetOHFmocArg(Pbf)OHFmocThr(t-Bu)OHFmocGln(Trt)OHDICHOBt*H2O126.2153.1397.4610.7648.8297.4610.7397.4353.4126.2153.1468.5411.50.840.840.70.70.70.70.70.71.051.261.261.051.05106/131129278428454208427278371159/196193492432371.5648.8397.4610.7126.2153.11.051.051.051.051.752.12.13906814176411069265/327322221221517;254181424520;2516Финальное деблокирование проводили с использованием EDT, как былоописано ранее.
Получено: 470 мг. На хроматограмме полученной смесиприсутствовало два основных пика. HRMS (ESI+), m/z: 1712.8342 ([М+Н]+),1840.8924 ([М+Н]+).Синтез фрагмента 111-130 белка РВ1 конвергентным способомH-Met1-Glu2-Val3-Val4-Gln5-Gln6-Thr7-Arg8-Met9-Asp10-Lys11-Leu12-Thr13-Gln14Gly15-Arg16-Gln17-Thr18-Tyr19-Asp20-OHРазбивка целевого соединения на фрагменты была проведена по остаткамглутамина и треонина в положениях 5 и 13 соответственно, былисинтезированы и выделены защищенные фрагменты 1-5 и 6-13 (таблицы 22 и 23соответственно).
Защищенный фрагмент 14-20 (таблица 24) не подвергалидеблокированию с полимерного носителя.Синтез защищенного фрагмента 1-5Fmoc-Met-Glu(O-tBu)-Val-Val-Gln(Trt)-ОНТаблица 22. Синтез защищенного фрагмента 1-5№реагентыМ,ν, ммоль87m, мг/ V,t, чг/моль123452-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocGln(Trt)OHFmocValOHDICHOBt*H2OFmocValOHFmocGlu(O-tBu)OHFmocMetOH1.14.40.81.61.921.921.61.61.6129.2610.7339.4126.2153.1339.4443.5371.5мкл700570/727490543242/30029454371059522322Получено 660 мг (72%).Синтез защищенного фрагмента 6-13Fmoc-Gln(Trt)-Thr(t-Bu)-Arg(Pbf)-Met-Asp(O-tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(t-Bu)-ОНТаблица 23. Синтез защищенного фрагмента 6-13№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocThr(t-Bu)OHFmocLeuOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocAsp(O-t-Bu)OHFmocMetOHFmocArg(Pbf)OHFmocThr(t-Bu)OHFmocGln(Trt)OH2345678М,г/моль129.2397.4353.4126.2153.1468.5411.5371.5648.8397.4610.7ν, ммольm, г/ V, млt, ч2.329.31.533.63.63333331.51.2/1.540.61.060.45/0.560.551.41.231.111.951.191.8322216524520Получено 1.976 г (67%).Синтез защищенного фрагмента 14-20Fmoc-Gln(Trt)-Gly-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Thr(t-Bu)-Tyr(t-Bu)-Asp(O-tBu)-ОНТаблица 24.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
