Автореферат (1150003)
Текст из файла
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТНа правах рукописиМатусевич Олег ВладимировичСИНТЕЗ И ИЗУЧЕНИЕ ФРАГМЕНТОВ РНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ВИРУСА ГРИППА АСпециальность 02.00.10 – биоорганическая химияАВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата химических наукСанкт-Петербург 2014Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательномучреждении высшего профессионального образования«Санкт-Петербургский государственный университет»Научный руководитель:Титов Михаил Ивановичдоктор химических наук,профессорОфициальные оппоненты:Позднев Владимир Федорович,доктор химических наук,главный научный сотрудникФГБУ НИИ биомедицинской химии имениВ.Н.Ореховича (г. Москва)Сидорова Мария Владимировна,кандидат химических наук,руководитель лаборатории синтеза пептидовФГБУ «Российский кардиологическийнаучно-производственный комплекс»Минздрава РФ (г.
Москва)Ведущая организация:ФГБУ Институт молекулярной генетикиРАН (г. Москва)Защита состоится ___________ 2014 г. в ___ часов на заседании советаД 212.232.28 по защите докторских и кандидатских диссертаций при СанктПетербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург,Средний пр., д. 41/43, Большая химическая аудитория.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. А.
М. Горького,СПбГУ, Университетская наб., д. 7/9 и на сайте www.spbu.ruАвтореферат разослан"2014 г."Учёный секретарьдиссертационного совета/В.Н.Сорокоумов/21. Общая характеристика работыАктуальность темы.В настоящее время выбор препаратов для терапии инфекционных заболеваний,вызванных вирусами гриппа, весьма ограничен. Высокая изменчивость вируса иразвитие резистентности к уже существующим препаратам диктуют необходимостьразработки противовирусных препаратов нового поколения.Для профилактики и лечения гриппа используют вакцины, интерфероны и ихиндукторы, а также препараты, непосредственно воздействующие на вирусные белки.К последним относятся четыре препарата, одобренных агенством FDA: дваингибитора нейраминидазы - занамивир и осельтамивир и два блокатора протонногоканала М2 – амантадин и ремантадин.
Препарат рибавирин, несмотря на широкийспектр противовирусной активности, используется при гриппе лишь по жизненнымпоказаниям вследствие большого количества побочных эффектов.ГеномвирусагриппаАкодирует16белков,которыемогутбытьпотенциальными лекарственными мишенями: гемагглютинин (HA), нейраминидазу(NA), матричный белок 1 (М1), протонный канал М2, нуклеопротеин (NP),неструктурный белок 1 (NS1), ядерный экспортный белок (NEP или NS2), белки M42,PB1-F2, PB1-F3 (N40), PA-X, PA-N155, PA-N182, а также три белка, составляющиеРНК-полимеразу - PB1, PB2 и РА. Несмотря на наличие в жизненном цикле вирусамножествапотенциальныхмишенейдляспецифическойхимиотерапии,насегодняшний день использованы немногие из них.Перспективной мишенью для химиотерапии гриппа являются консервативныебелки: использование таких мишеней может позволить в значительной степениизбежать проблемы формирования резистентности к препаратам. Одной из такихмишеней, не задействованной в современных препаратах, использующихся вклинической практике, в случае вируса гриппа А является фермент РНК – полимераза,катализирующий синтез вирусной РНК.
Белки, составляющие этот фермент - PB1, PB2иРА,являютсяконсервативными.Сборкаферментамежмолекулярного взаимодействия этих белков (Рис. 1).3осуществляетсяпутемРис. 1 Схема структурной организации РНК-полимеразы вируса гриппа. Косымилиниями показаны взаимодействующие участки субъединиц.Белок РВ1 является ключевым компонентом полимеразного комплекса, так каксодержит активный центр фермента, а также два домена, взаимодействующих ссубъединицами РВ2 и РА.Цель работы: поиск пептидов из аминокислотной последовательности белкаРВ1, подавляющих репликацию вируса гриппа А. Для достижения поставленной целив работе были решены следующие задачи:1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1;2.
разработка синтеза целевых соединений;3. тестирование синтезированных пептидов;4. модификация наиболее активных соединений с целью увеличения их биологическойактивности.Научная новизна исследования:1. Разработан синтез 34 ранее неизвестных пептидов – фрагментов белка РВ1 РНКполимеразы вируса гриппа А.2. На основании изучения противовирусной активности синтезированных соединенийнакультуреклетокMDCKвотношениипандемическоговирусагриппаA/California/07/2009 (H1N1) pdm09 впервые показано, что пептиды – фрагменты 6-13,6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1, а также их производные эффективноподавляют репликацию вируса гриппа.3. Изучение флуоресцентно-меченого фрагмента 6-14 белка РВ1 показало, чтопрепарат действует внутри клетки на ранних стадиях репликации вируса гриппа.Практическая ценность работы.
В ряду синтезированных пептидов выявленысоединениясвысокойпротивовируснойактивностью,которыемогутбытьиспользованы в качестве основы для создания лекарственных препаратов дляпрофилактики и лечения гриппа А. Получен патент на пептид, обладающий высокойпротивовирусной активностью.4На защиту выносятся положения и результаты проведенного исследования,включающие:1. выбор пептидов из аминокислотной последовательности белка РВ1, входящего всостав РНК-полимеразы вируса гриппа А;2. синтез 34 пептидов – фрагментов белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А;3. на основании изучения противовирусной активности синтезированных пептидоввыявлены соединения, эффективно подавляющие репликацию пандемического вирусагриппа A/California/07/2009 (H1N1) pdm09 в культуре клеток MDCK.Личныйвкладавтора.Основнаячастьработывыполненаавторомсамостоятельно. Она включает в себя непосредственное получение экспериментальныхданных, разработку методологии исследования и интерпретацию полученныхрезультатов, формулировку цели, задач и выводов данной работы, написание ипубликацию статей.Апробация диссертационной работы.
Материал диссертации был представленна 4 конференциях и 2 симпозиумах, как российских, так и международных. По темедиссертации опубликованы 2 статьи, 1 патент, тезисы 7 докладов.Объем и структура диссертации. Работа изложена на 127 страницах, содержит37 таблиц и 22 рисунка. Диссертация состоит из введения, литературного обзора,обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов, заключения, спискацитированной литературы из 192 наименований.Благодарности.Авторвыражаетискреннююблагодарностьнаучномуруководителю, профессору М.И. Титову, коллективу лаборатории синтеза пептидов:И.А. Глуздикову, С.К. Никольской, И.И.
Елисееву, А.А. Краснощек, сотрудникам НИИГриппа: О.И. Киселеву, В.В. Зарубаеву, А.А. Штро, В.В. Егорову, Ю.П. Гармаю, А.В.Слите, М.И. Дюкову за неоценимую помощь и поддержку при выполнениидиссертационной работы.2. Основные результаты и их обсуждениеДля поиска новых пептидных противовирусных препаратов из аминокислотнойпоследовательности белка РВ1 (штамм A/Hong Kong/156/97(H5N1)) были выбранывыделенные на рисунке 2 области: 1-30, 111-130, 271-290, 381-420, 525-540. Этиконсервативные области высокопатогенного штамма H5N1 и наиболее актуальногоA/California/07/2009 (H1N1) pdm09 отличаются лишь на 1 неэквивалентную заменуMet119Val.5Рис.
2 Аминокислотная последовательность белка РВ1 вируса гриппа A/HongKong/156/97(H5N1). Серым цветом выделены выбранные для исследования области.Из литературы известно, что наиболее важным для связывания с белком РАявляется фрагмент 1-15 белка РВ1. Наличие в клетке фрагмента 1-25 белка РВ1подавляет репликацию вируса в клетке. Авторы исследований при этом полагают, чтопептидный ингибитор конкурирует с белком РВ1 за связывание с белком РА.Учитывая вышеперечисленное, мы решили более детально изучить эту область.При анализе первичной структуры N-концевой части белка РВ1 былоустановлено, что фрагмент 6-25 содержит зеркально-симметричный мотив (рисунок 3).Из литературы известно, что такие мотивы чаще встречаются вблизи функциональнозначимых участков белков.Рис.
3 Зеркально-симметричный мотив в структуре фрагмента 6-25 белка РВ1.Аминокислотные остатки в симметричных позициях обозначены жирным шрифтом, авзаимодействующие с белком РА подчёркнуты.6Для изучения пространственной структуры фрагмента 6-25 сотрудникамилаборатории структурной и функциональной протеомики НИИ Гриппа было проведенокомпьютерное моделирование структуры этого пептида методами молекулярнойдинамики. По расчетным данным, соединение образует структуры типа β-шпильки(рисунок 4); аминокислотные остатки, необходимые для стабилизации даннойструктуры, находятся в районе фрагмента 6-13.Рис. 4 Предполагаемая пространственная структура фрагмента 6-25 белка РВ1 поданным компьютерного моделирования.По результатам моделирования пространственной структуры фрагмент 6-13склонен к образованию линейной структуры и не образует внутримолекулярные связи.На основании вышеизложенного мы предполагаем, что фрагменты 6-13 и 6-25 белкаРВ1могутвзаимодействоватьдругсдругомвследствиеконкуренциизавнутримолекулярные связи фрагмента 6-13 с той частью молекулы пептида 6-25,которая образует β-структуру.
Таким образом возможна стабилизация N-концевойчасти белка РВ1 в виде β-структуры, препятствующей взаимодействию белков РВ1 иРА, что, как следствие, будет приводить к ингибированию вирусной репликации вклетке.Выбор пептидов, не принадлежащих N-концу белка РВ1, был во многомпроизвольным, при этом принимали во внимание такие факторы, как гидрофобность,7растворимость, способность проникать сквозь клеточную мембрану, наличие кластеровповторяющихся аминокислотных остатков.Так, например, фрагмент 525-540 белка РВ1 был выбран, поскольку содержиткластер из остатков аспарагина. Известно, что кластеры остатков аспарагина илиглутамина повышают склонность белков к образованию амилоидных агрегатов, гдепреобладает β-складчатая структура. На основании вышесказанного было сделанопредположение, что пептид РВ1 531-540 может быть блокатором образования βскладчатойструктурыинарушатьстабильностьсоответствующегодоменаполноразмерного белка.
По сходному принципу был выбран участок 111-130,содержащий повтор глутамина, а также повтор остатков валина.Сравнение различных вариантов проводилось согласно расчетам индексов,предложенных в 2005 году Хэлбринком и соавторами.В результате для синтеза были выбраны следующие пептиды - фрагменты белкаPB1: 1-5, 1-25, 6-13, 6-14, 6-25, 14-25, 26-30, 111-130, 271-290, 381-386, 381-390, 381400, 391-400, 395-400, 411-420, 525-530, 525-535, 531-540.2.1 Синтез пептидовСинтез пептидов проводили твердофазным методом на 2-хлортритилхлориднойи Ринк-амидной смолах по Fmoc-/t-Bu стратегии с использованием как методикпоследовательного наращивания цепи, так и конвергентного подхода.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
