Автореферат (1150003), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Такой выбор обусловлен весьма низкойспособностью пролина подвергаться рацемизации.15В случае пептида PB1(381-400)разбивку проводили также по аргинину в положении 6. В конденсациях использовали2-3.5-кратные избытки защищенных фрагментов.В случае фрагмента 1-25 целевое соединение, полученное с использованиемконвергентного синтеза на хроматограмме совпадало с таковым, полученнымпоследовательным наращиванием пептидной цепи. Лучшие результаты были полученыв случае конвергентного синтеза.2.2 Противовирусная активность пептидовИспытания по противовирусной активности пептидовбыли проведенысотрудниками лаборатории молекулярных основ химиотерапии вирусных инфекцийНИИ Гриппа на культуре клеток MDCK, активность оценивали в отношении вирусагриппа (A/California/07/2009 (H1N1) pdm09), вызвавшего пандемию в 2009 году.
Вэкспериментах оценивали 50%-е цитотоксическую (CTD50) и эффективную (ED50)дозы, на основании которых рассчитывали индекс селективности (SI). Считалиактивными препараты, имеющие SI >10.Первоначально были протестированы базовые соединения 1-18 (таблица 4), длядальнейшей работы были выбраны наиболее активные. В качестве препаратовсравнения были выбраны ремантадин, в отношении которого исследуемый штаммобладает устойчивостью, а также осельтамивир, к которому он чувствителен.Таблица 4.
Противовирусная активность базовых пептидов№123456789101112обозначенияпептидовPB1 (1-5)PB1 (1-25)PB1 (6-13)PB1 (6-14)PB1 (6-25)PB1 (14-25)PB1 (26-30)PB1(111-130)PB1(271-290)PB1(381-386)PB1(381-390)PB1(381-400)показатели активностиCTD50, мкг/млED50, мкг/мл7451000100010001000100010005006001000500330106340953428750063140725005005416SI7.02.910.529.43.52.015.93.68.32.01.06.1131415161718PB1(391-400)PB1(395-400)PB1(411-420)PB1(525-530)PB1(525-535)PB1(531-540)ремантадиносельтамивир7008010005710004111000500500500100058препараты сравнения50203000.38.717.52.42.01.017.22.51000Как следует из приведенных в таблице 4 данных, синтезированные соединениянетоксичны для клеток. Наиболее активными в отношении вируса гриппа пептидамиявляются фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540 белка РВ1 (соединения 3, 4, 7,14, 18).
Интересно отметить, что соединения 14 и 18 не являются фрагментами Nконцевой области белка РВ1, необходимой для связывания с белком РА.Индексы селективности фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения 3 и 4)отличаются почти в три раза. Возможно, это связано с увеличением количествапроникшего в клетки соединения 4 по сравнению с соединением 3 за счет наличия всоставе соединения 4 гидрофобного остатка аланина. Кроме того, остаток аланина вположении 14 белка РВ1 взаимодействует с остатком глутамина-670 белка РА.Для увеличения стабильности и биодоступности наиболее активных соединенийбыло решено синтезировать модифицированные пептиды – ацетилированные по Nконцевой аминогруппе и амидированные по С-концевой карбоксильной группе.Данные модификации позволяют повысить устойчивость пептидов к экзопептидазам иоблегчить их проникновение через клеточную мембрану.
Результаты тестированияпредставлены в таблице 5.Таблица 5. Противовирусная активность модифицированных пептидов№33а3б3в44а4баминокислотная последовательностьH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OHH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH2Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-OHAc-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-NH2H-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OHH-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2Ac-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-OH17показатели активностиCTD50ED50SIмкг/мл мкг/мл10009510.510003231.210003231.2>50011>45>50033>15>5006>8310008511.84в4г77а7б7в1414а14б14в1818а18б18вAc-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2FITC-Ahx-Thr-Leu-Leu-Phe-Leu-Lys-Val-Pro-Ala-NH2H-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-OHH-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-NH2Ac-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-OHAc-Gly-Asp-Pro-Pro-Tyr-NH2H-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OHH-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-NH2Ac-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-OHAc-Leu-Leu-Val-Glu-Gly-Thr-NH2H-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-OHH-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-Leu-Gly-NH2Ac-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-OHAc-Lys-Asn-Asn-Met-Ile-Asn-Asn-Asp-LeuGly-NH2>500>5004.55>111>10010001000100050010005005005001000100010006355561505750020050058508315.918.217.93.317.51.02.51.017.220.012.010001287.8Как следует из таблицы, во всех случаях, кроме производных фрагмента 395-400(соединения 14, 14 а-в), амиды оказались более активными, чем соответствующиекислоты, а введение N-концевой ацетильной группы в амиды пептидов привело кувеличению активности только в случае фрагментов 6-13 и 6-14 белка РВ1 (соединения3 и 4).
Наиболее активным из всех протестированных соединений оказалосьсоединение 4в, имеющее SI >111.Для изучения механизма противовирусной активности этого соединения вследующей серии опытов были изучены его вирулицидные свойства (противовируснаяактивность вне клеток) и клеточная локализация.Эксперименты по вирулицидному действию соединений 4в и 4г показалиснижение титра вируса на 1.5 и 1 lgEID50 по сравнению с контролем, чтосвидетельствует об их слабом вирулицидном действии.
Вероятно, данный механизм неявляется основным для этих соединений.Также был проведен эксперимент по изучению влияния соединения 4в наразличные стадии жизненного цикла вируса гриппа. Полученные данные позволилисделать вывод о том, что соединение 4в, вероятно, влияет на ранние стадиижизненного цикла вируса гриппа.Для изучения способности соединения 4в к проникновению в клетки в амидсоответствующего пептида была введена флуоресцентная метка с помощьюфлуоресцеин-5-изотиоцианата,линкером18выступала6-аминогексановаякислота.Введение флуоресцентной метки практически не отразилось на противовируснойактивности изучаемого препарата (4г, таблица 5) что свидетельствует о сходствемеханизмов действия соединений 4в и 4г.Исследование локализации флуоресцентно-меченого соединения 4г в клеткахMDCK с помощью проточной цитофлуориметрии и флуоресцентной микроскопиипозволило сделать вывод о том, что исследуемое соединение проникает через клеточнуюмембрану.
С помощью проточной цитофлуориметрии было показано, что данныйпептид способен к связыванию с живыми клетками MDCK. Изучение окрашенныхклеток с помощью флуоресцентной микроскопии показало, что окрашиваниепроисходит за счёт проникновения соединения 4г сквозь мембрану клетки.Вероятно, противовирусная активность соединения 4в – N-ацетилированногоамида фрагмента 6-14 белка РВ1 реализуется путем нарушения сборки комплекса РНКполимеразы либо за счет связывания пептида 4в с белком РА, либо за счетстабилизации β-структурированного состояния N-концевой части белка РВ1.Данное соединение, на наш взгляд, является перспективной основой длядальнейшей разработки средств профилактики и/или терапии гриппа.3. Выводы1.
Разработан синтез пептидов из областей 1-30, 111-130, 271-290, 381-400, 525-540белка РВ1 РНК-полимеразы вируса гриппа А. Всего получено 34 соединения.2. На основании изучения противовирусной активности синтезированных соединений накультуре клеток MDCK в отношении пандемического вируса гриппа A/California/07/2009(H1N1) pdm09 показано, что пептиды – фрагменты 6-13, 6-14, 26-30, 395-400, 531-540белка РВ1, а также их производные эффективно подавляют репликацию вируса гриппа.3. Изучение флуоресцентно-меченого фрагмента 6-14 белка РВ1 показало, чтопрепарат проникает через мембрану клетки и действует на ранних стадиях репликациивируса гриппа.Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:Статьи:1. Матусевич, О. В.; Глуздиков, И.
А.; Титов, М. И. Синтез фрагментов субъединицыPB1РНК-полимеразывирусовгриппаА//университета. – 2011. – серия 4. вып. 2. – С. 150–156.19ВестникСанкт-Петербургского2. Egorov, V. V.; Matusevich, O. V.; Shaldzhyan, A. A.; Skvortsov, A. N.; Zabrodskaya, Y. A.;Garmay, Y. P.; Landa, S. B.; Lebedev, D. V.; Zarubayev, V. V.; Sirotkin, A. K.; Vasin, A. V.;Kiselev, O. I.
Structural features of the peptide homologous to 6-25 fragment of influenza A PB1protein // International Journal of Peptides. – 2013. – Vol. 2013. – ID 370832.Патент:Киселёв, О. И.; Деева, Э. Г.; Зарубаев, В. В.; Штро, А. А.; Матусевич, О. В.; Титов, М. И.;Глуздиков, И. А. Пат. 2492178 РФ С1.
Противовирусный пептид, подавляющийрепликацию вируса гриппа – № 2012115794/10; заявл. 19.04.2012; опубл. 10.09.2013, Бюл.№ 25. 12 С.Тезисы докладов:1. Matusevich, O. V.; Kiselev, O. I. The Synthesis of Some Peptides Intended to BeInhibitors of the RNA-Polymerase of Influenza A Virus // Proceedings of the 31st EuropeanPeptide Symposium, Copenhagen, Denmark, September 5-9, 2010.
P. 548.2. Matusevich, O. V. Synthesis of the PB1protein fragment ofRNA–polymerase ofinfluenza A virus // Journal of Peptide Science. – 2010. – Vol. 16. S1. – P. 65.3. Глуздиков, И. А.; Краснощек, А. А.; Матусевич, О. В.; Титов, М. И.; Киселев, О. И.Синтез фрагментов белка PB1-cубъединицы РНК-полимеразы вируса гриппа типа А //Тез. докл. IV Российского симпозиума “Белки и пептиды”, Казань, 23-27 июня 2009.
С. 147.4. Матусевич, О. В. Синтез фрагмента белка PB1 РНК-полимеразы вируса гриппа А //Материалы междунар. конф. "Основные тенденции развития химии в начале XXI-говека”, Санкт-Петербург, 21-24 апреля 2009. С. 403.5. Матусевич, О. В.; Глуздиков, И. А. Синтез фрагмента PB1 (111-130) РНКполимеразы вируса гриппа А // Тез. докл.
V Всерос. конф. студентов и аспирантов“Химия в современном мире”, Санкт-Петербург, 2011. – СПб: ВВМ, 2011. – С. 404.6. Забродская, Я. А.; Шалджян, А. А.; Матусевич, О. В.; Егоров, В. В. Пептиды, способныек взаимодействию с белками вируса гриппа // Тез. докл. конф. молодых специалистов“Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение”, СПб, 2012. С. 21.7. Забродская, Я. А.; Егоров, В. В.; Матусевич, О. В.; Гармай, Ю. П.; Васин, А.
В.;Киселёв, О. И. Структурные особенности сайта связывания белка РВ1 и белка РАвируса гриппа А // Тез. докл. 16-й Междунар. школы-конф. молодых ученых “Биология– наука ХХI века”, Пущино, 16-21 апреля, 2012. С. 109.20.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
