Автореферат (1150003), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Очисткуполученных пептидов проводили методом препаративной обращеннофазной ВЭЖХ,их структура подтверждена масс-спектрометрически (ESI).Для фрагментов 6-13, 6-14, 26-30, 395-400 и 531-540 были получены амиды, атакже N-ацетилированные производные пептидов и их амидов. Аминокислотныепоследовательности синтезированных пептидов и их производных представлены втаблицах 1 и 2 соответственно.8Таблица 1. Базовые пептиды 1-18№обозначенияпептидоваминокислотная последовательность12PB1 (1-5)PB1 (1-25)3PB1 (6-13)4PB1 (6-14)5PB1 (6-25)6PB1 (14-25)78PB1 (26-30)PB1(111-130)9PB1(271-290)1011PB1(381-386)PB1(381-390)12PB1(381-400)H-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-OHH-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-||-Thr6-Leu7Leu8-Phe9-Leu10-Lys11-Val12-Pro13-||-Ala14Gln15-Asn16-Ala17-Ile18-Ser19-Thr20-Thr21Phe22-Pro23-Tyr24-Thr25-OHH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7Pro8-OH12H-Thr -Leu -Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7Pro8-Ala9-OHH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7Pro8-||-Ala9-Gln10-Asn11-Ala12-Ile13-Ser14Thr15-Thr16-Phe17-Pro18-Tyr19-Thr20-OHH-Ala1-Gln2-Asn3-Ala4-Ile5-Ser6-Thr7-Thr8Phe9-Pro10-Tyr11-Thr12-OHH-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-OHH-Met1-Glu2-Val3-Val4-Gln5-||-Gln6-Thr7Arg8-Met9-Asp10-Lys11-Leu12-Thr13-||-Gln14Gly15-Arg16-Gln17-Thr18-Tyr19-Asp20-OHH-Leu1-Pro2-Val3-Gly4-Gly5-Asn6-Glu7Lys8-Lys9-Ala10-Lys11-Leu12-Ala13-Asn14Val15-Val16-Arg17-Lys18-Met19-Met20-OHH-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-OHH-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-Lys7Lys8-Ile9-Glu10-OHH-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-||-Lys79Выход,%*6422 **Чистота,(ВЭЖХ)95.196.3[M+H]+расcчитано[M+H]+найдено575.24942781.4532575.25122781.46433298.6930.6023930.60382698.81001.63941001.63542897.52225.22162225.21272998.11313.63721313.6428773296.494.5548.23512427.1755548.23322427.18491497.22183.25152183.2597573795.795.2753.35261251.6692753.35521251.66461996.32358.35032358.359413PB1(391-400)1415PB1(395-400)PB1(411-420)1617PB1(525-530)PB1(525-535)18PB1(531-540)Lys8-Ile9-Glu10-Lys11-Ile12-Arg13-Pro14-||Leu15-Leu16-Val17-Glu18-Gly19-Thr20-OHH-Lys1-Ile2-Arg3-Pro4-Leu5-Leu6-Val7-Glu8Gly9-Thr10-OH1H-Leu -Leu2-Val3-Glu4-Gly5-Thr6-OHH-Met1-Phe2-Asn3-Met4-Leu5-Ser6-Thr7-Val8Leu9-Gly10-OH1H-Ile -Gly2-Val3-Thr4-Val5-Ile6-OHH-Ile1-Gly2-Val3-Thr4-Val5-Ile6-Lys7-Asn8Asn9-Met10-Ile11-OHH-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7Asp8-Leu9-Gly10-OH3396.51125.69901125.6948483796.994.9631.36611112.5479631.36301112.5447292795.394.7601.39191201.6973601.39011201.69294194.51132.54151132.5457Примечание: знаком || обозначены фрагменты для конвергентного синтеза.* выход приведен в расчете на первый аминокислотный остаток с учетом очистки пептида с помощью препаративнойобращенно-фазной ВЭЖХ** выход приведен для пептида, синтезированного последовательным наращиванием пептидной цепи10Таблица 2.
Производные базовых пептидов 3 а-в, 4 а-г, 7 а-в, 14 а-в, 18 а-в№обозначенияпептидоваминокислотная последовательностьВыход%*Чистота(ВЭЖХ)93.594.897.297.3[M+H]+расcчитано[M+H]+найденоH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH227929.6183929.620212345678Ac-Thr -Leu -Leu -Phe -Leu -Lys -Val -Pro -OH15972.6128972.609812345678Ac-Thr -Leu -Leu -Phe -Leu -Lys -Val -Pro -NH234971.6288971.625612345678H-Thr -Leu -Leu -Phe -Leu -Lys -Val -Pro 591000.65541000.65619-Ala -NH2123Ac-Thr-Leu-Leu-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro84б1993.61043.64991043.6528PB19-Ala -OH(6-14)123Ac-Thr -Leu -Leu -Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro84в2895.21042.66591042.6628-Ala9-NH2FITC-Ahx1-Thr2-Leu3-Leu4-Phe5-Leu6-Lys7-Val84г3094.31502.77521502.7805910Pro -Ala -NH2H-Gly1-Asp2-Pro3-Pro4-Tyr5-NH27аPB13897.7547.2511547.249712345Ac-Gly -Asp -Pro -Pro -Tyr -OH7б5098.1590.2457590.2466(26-30)12345Ac-Gly -Asp -Pro -Pro -Tyr -NH27в3496.2589.2616589.2595123456H-Leu -Leu -Val -Glu -Gly -Thr -NH214аPB17198.7630.3821630.3793123456(395Ac-Leu -Leu -Val -Glu -Gly -Thr -OH14б3698.0673.3767673.3737123456400)Ac-Leu -Leu -Val -Glu -Gly -Thr -NH214в6997.3672.3927672.3916123456789H-Lys -Asn -Asn -Met -Ile -Asn -Asn -Asp -Leu 18а3495.41131.55751131.554110-Gly -NH2PB1123Ac-Lys-Asn-Asn-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp818б2993.51174.55211174.5553(531-Leu9-Gly10-OH540)Ac-Lys1-Asn2-Asn3-Met4-Ile5-Asn6-Asn7-Asp818в2393.71173.56811173.5728-Leu9-Gly10-NH2* выход приведен в расчете на первый аминокислотный остаток с учетом очистки пептида с помощью препаративнойобращенно-фазной ВЭЖХ3а3б3в4аPB1(6-13)112.1.1 Последовательное наращивание пептидной цепиВсе представленные в таблице 1 пептиды, кроме PB1(111-130) и PB1(381-400)были синтезированы последовательным наращиванием пептидной цепи по однойаминокислоте.
Пептид РВ1 (1-25) был синтезирован двумя способами – указаннымвыше, а также конвергентно.Синтетические проблемы при “посадке” следующего аминокислотного остаткаили же деблокировании Fmoc-группы при синтезе всех обсуждаемых пептидоввозникали, чаще всего, в реакциях с гидрофобными, пространственно-затрудненнымизащищенными аминокислотами – Val, Leu, Ile, Asn, Gln, а также Lys, особенно, еслиони оказывались соседними в аминокислотной последовательности.Фрагмент111-130белкаРВ1(соединение8)неудалосьполучитьпоследовательным наращиванием пептидной цепи - проблемы в синтезе былиотмечены при присоединении остатка глутамина в положении 6:Fmoc-Gln6(Trt)-OH+H2N-Thr7(t-Bu)-Arg8(Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lys11(Boc)-Leu12-Thr13(t-Bu)-Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)-Asp20(OtBu)DIC, HOBtFmoc-Gln6(Trt)-Thr7(t-Bu)-Arg8(Pbf)-Met9-Asp10(O-tBu)-Lys11(Boc)-Leu12-Thr13(t-Bu)Gln14(Trt)-Gly15-Arg16(Pbf)-Gln17(Trt)-Thr18(t-Bu)-Tyr19(t-Bu)-Asp20(O-tBu)Реакцию не удавалось провести до конца.
По данным аналитической обращенофазной ВЭЖХ смесь продуктов, полученная после финального деблокирования,содержала два пика, отвечающие, по данным масс-спектрометрии, пептидам 6-20 и 720 соответственно:H-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OHH-Gln-Thr-Arg-Met-Asp-Lys-Leu-Thr-Gln-Gly-Arg-Gln-Thr-Tyr-Asp-OHЦелевоесоединениеудалосьполучитьконвергентнымметодомприиспользовании фрагментов 1-5, 6-13 и 14-20.Пептид PB1(271-290) (соединение 9), синтезированный последовательнымнаращиванием пептидной цепи, содержит два остатка метионина в положениях 19 и20. После финального деблокирования данного пептида на хроматограмме полученнойсмеси присутствовало 4 пика (рисунок 5а).12Рис. 5 Хроматограммы пептида PB1(271-290) (RP-HPLC) а) после финальногодеблокирования б) после восстановления.Мы предположили, что пики 1-3 соответствуют соединениям, содержащимокисленные формы остатков метионина (рисунок 6):Рис.
6 Окисленные формы остатков метионина.Действительно, восстановление данной смеси с помощью 1,2-этандитиола итриметилбромсилана в растворе трифторуксусной кислоты привело к целевомусоединению, соответствующему пику 4 (рисунок 5б).Аналогичная картина наблюдалась с пептидом PB1 (525-535) (соединение 17),содержащим один остаток метионина в положении 10 – на рисунке 7 представленыхроматограммы до (а) и после (б) его восстановления: пики 1 и 3 соответствуютокисленной форме, а пик 2 - целевому соединению.
Пику 4 соответствует Fmocзащищенный пептид, что подтверждается исчезновением данной группы пиков (3 и 4)после обработки смеси водным раствором аммиака.13Рис. 7 Хроматограммы пептида PB1(525-535) (RP-HPLC) а) после финальногодеблокированиия б) после восстановления.Синтез фрагмента 6-13 белка РВ1 (соединение 3) и его N-ацетилированногопроизводного (соединение 3б, таблица 2)H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHAc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-OHне представляет сложностей в условиях твердофазного синтеза.
Однако синтез в такихже условиях фрагмента 6-14 белка РВ1 и его N-ацетилированного производного(соединения 4 и 4б),H-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OHAc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-Ala9-OHотличающихся от фрагмента 6-13 остатком аланина в положении 9, приводит квозникновению проблем как с присоединением треонина-1, так и с последующимдеблокированием Fmoc-группы.
В данном случае эти проблемы решает увеличениеизбытка реагентов на стадии присоединения Thr-1, а также времени протеканияреакции. Для деблокирования Fmoc-группы Thr-1 в случае соединений 4 и 4бвозникает необходимость в использовании более эффективного реагента DBU (1,8диазабицикло[5.4.0]ундец-7-ен).Амид фрагмента 6-13 (соединение 3а) был получен амидированием, котороепроводилисиспользованиемаммиачнойсолигидроксибензотриазоладиизопропилкарбодиимида:Boc-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OH1) DIC/NH4OBt2) TFA/TIS/H2OH-Thr1-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6-Val7-Pro8-NH214иПолучить соединения 3в и 7в описанным выше способом не удалось – реакциине проходили до конца при увеличении как избытка реагентов, так и временипротекания реакции. Синтез соединения 3в также осложнялся плохой растворимостьюзащищенного пептида:Ac-Thr1(t-Bu)-Leu2-Leu3-Phe4-Leu5-Lys6(Boc)-Val7-Pro8-OHПоэтому соединения 3в и 7в, а также соединения 4а, 4в, 4г, 7а, 14а, 14в, 18а, 18вбыли синтезированы с использованием Ринк-амидной смолы, позволяющей получатьсоответствующие амиды на стадии отщепления от полимерного носителя.
Получаемыетаким образом амиды не содержат примесей соответствующих кислот (как в случаепроведения реакции амидирования с помощью карбодиимида), что упрощает очисткуцелевых соединений.2.1.2 Конвергентный синтезКонвергентно были синтезированы пептиды PB1 (1-25), PB1 (111-130) и PB1 (381400) (таблица 3).Таблица 3. Конвергентный синтез пептидов№обозначенияпептидов2конденсациифрагментоврастворительизбытоккарбоксильнойкомпоненты(6-13) + (14-25)HOBtNMPPB1 (1-25)2.0(1-5) + (6-25)HOBtDMF8PB1122.7(6-13) + (14-20)(111-130)PB1(381-400)реагент(1-5) + (6-20)(7-14) + (15-20)(1-6) + (7-20)HOAtDMFDMFDMFDMF2.93.02.43.5HOAtHOAtHOAtНаличие в молекулах PB1 (1-25), PB1(381-400) остатков пролина в положениях5, 13 (для PB1 (1-25)), 14 (для PB1(381-400)) открыло возможности для использованиявихсинтезефрагментныхконденсацийсразбивкойаминокислотнойпоследовательности по данной аминокислоте.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
