Диссертация (1150004), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Для оценки токсичностив опытах на клеточной культуре MDCK из исследуемых соединений готовилисерию двукратных разведений в концентрации от 500 до 3.9 мкг/мл наподдерживающей среде Альфа-МЕМ. Разведения препаратов вносили в лунки96-луночных планшетов. Клетки инкубировали в течение 48 часов при 37˚С ватмосфере 5% CO2. Затем проводили микротетразолиевый тест (МТТ).
Клеткипромывали 2 раза физиологическим раствором (0.9% NaCl) и добавляли по 100мкл/лунку раствора МТТ (3-(4.5-диметилтиазол-2)-2.5 дифенил тетразолиябромид), в концентрации 0.5 мкг/мл в физиологическом растворе. Планшетыинкубировали в течение часа при 37˚С, после чего жидкость удаляли идобавляли в лунки по 0.1 мл диметилсульфоксида.
Оптическую плотностьячеек измеряли на спектрофотометре Victor 2 1440 при длине волны 535 нм. Наосновании полученных данных рассчитывали CTD50, т.е. концентрациюпрепарата, разрушающую 50% клеток в культуре.Изучениепротивовируснойактивностипептидовinvitro.Конфлюэнтный монослой клеток MDCK заражали по следующей схеме: влунки 96-луночного планшета добавляли по 100 мкл растворенного вподдерживающей среде пептида, инкубировали 1 час при 37˚С в атмосфере 5%CO2. Затем добавляли по 100 мкл 10-кратных (10-1 – 10-7) разведений вируса иоставляли на двое суток при 37˚С и 5% CO2.Через 48 часов из лунок отбирали по 100 мкл культуральной жидкости ивносили в планшет для иммунологических реакций, затем проводили реакциюгемагглютинации (РГА).
Для этого в лунки с отобранной культуральнойжидкостью добавляли равное количество 1% суспензии куриных эритроцитов вфизиологическом растворе. Результаты учитывали через 30 минут инкубациипри комнатной температуре. За инфекционный титр вируса принималинаибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинацию эритроцитов.Титрвыражаливдесятичныхлогарифмах50%экспериментальнойинфекционной дозы (lg EID50).По снижению инфекционного титра вируса судили о противовируснойактивности соединений.
На основании полученных данных рассчитывали68концентрацию препарата, которая вызывала снижение титра вируса вдвое (на0.3 lg EID50), а затем рассчитывали индекс селективности (SI) – отношениеCTD50/ED50.Вирулицидноеразведениидействие.выдерживалисПрепаратвнаибольшемразведеннымв10разнетоксичномвирусомгриппаA/California/7/09 в течении 1 часа при температуре 37°С. Десятикратнымиразведения вируса от 10-1 до 10-6заражаликлетки MDCK, которыеинкубировали в течение 48 часов при 37˚С в атмосфере 5% CO2.Инфекционную активность вируса оценивали в реакции гемагглютинации(РГА)скуринымиэритроцитами.Влункимикропланшетадляиммунологических реакций добавляли 100 мкл вируссодержащей среды изсоответствующей лунки планшета для клеточных культур, после чего в лункивносили равное количество 1% суспензии куриных эритроцитов.
Реакциюучитывали через 30-40 минут при комнатной температуре. За титрвирусапринимали наибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинациюэритроцитов. Вирулицидную активность соединения оценивали по снижениютитра вируса по сравнению с контролем.Оценка влияния времени добавления препарата. Культуру клетокMDCK выращивали в течение суток на среде Альфа-МЕМ с 10 % сывороткиплода коровы, затем промывали физиологическим раствором и заливалисвежей средой с добавлением трипсина (концентрация 1 мкг/мл). Препарат внаибольшей нетоксичной концентрации добавляли в следующие моменты: -2по -1 (до адсорбции вируса), -1 по 0 (адсорбция), а также в несколько моментовпосле адсорбции: 0-1, 0-2 2-4 и 4-10 часов. Через 10 часов клетки собирали и изполученной суспензии делали ряд десятикратных разведений, которыевысевали на культуру клеток MDCK, и инкубировали в течение 48 часов при37˚С и 5% CO2.Инфекционную активность вируса оценивали в реакциигемагглютинации (РГА) с куриными эритроцитами.
В лунки микропланшетадля иммунологических реакций добавляли 100 мкл вируссодержащей среды изсоответствующей лунки планшета для клеточных культур, после чего в лунки69вносили равное количество 1% суспензии куриных эритроцитов. Реакциюучитывали через 30-40 минут при комнатной температуре. За титрвирусапринимали наибольшее разведение вируса, вызвавшее полную агглютинациюэритроцитов.Проточная цитофлуориметрия.
В 6 луночные планшеты, содержащиемонослойную культуру клеток MDCK, вносили по 100 мкл на лункурастворенного в поддерживающей среде пептида (концентрация 50 мкг/мл) илиподдерживающей среды и инкубировали 1 час при 36˚С и 5% CO 2. Послеинкубации клетки снимали с культуральной поверхности с помощью растворааккутазы (Sigma), дважды отмывали фосфатным физиологическим буфером иресуспензировали(0,5×106клеток/мл)вфизиологическомрастворе,содержащем 2% фетальной сыворотки.
Перед анализом, для определенияжизнеспособности, клетки были дополнительно окрашены 7-AAD (Invitrogen).Анализ образцов проводили на проточном цитофлюориметре Navios™(Beckman Coulter, США), оснащенном двумя диодными лазерами 488 и 638 нм.Длякорректногоисключенияиззоныанализаклеток,которыенесоответствовали по размерам и структуре неповрежденным MDCK, вводилинеобходимые логические ограничения в гистограммы распределения частиц помалоугловому и боковому светорассеянию. Математическую обработкуцитофлуориметрических данных проводили при помощи программ NaviosSoftware v.1.2 и Kaluza™ v.1.2 (Beckman Coulter, США).Флуоресцентнаямикроскопия.Тестированиеэффективностипроникновения исследуемого пептида, содержащего флуоресцентную метку,через клеточную мембрану проводили в культуре клеток MDCK, выращеннойдо состояния 100 % монослоя в 96-луночном полистироловом планшете(“Nunc”, Дания).
Из планшета с выращенными клетками удаляли ростовуюсреду и добавляли в лунки по 100 мкл раствора меченого пептида (30 мкг/мл).Планшеты инкубировали при 360С в атмосфере 5% СО2. Через 60 и 120 минутклеткиотмывалиотрастворапептидаинаблюдалиспомощьюлюминесцентного инвертированного микроскопа (“Leica DM IL”, Австрия),70результаты фиксировали с помощью цифровой фотокамеры (“Leica DFC 290”,Австрия).4.2 Синтез пептидовПептиды, полученные последовательным наращиванием цепи по однойаминокислоте с использованием 2-хлортритилхлоридной смолы в описанныхвыше условиях синтезировали по следующей общей методике [44]:1. В твердофазном реакторе суспендировали 0.5г смолыв 10 мл DCM,выдерживали в течение 2 мин и отфильтровывали смолу.2.Ксмоледобавлялираствор0.5ммольC-концевойзащищеннойаминокислоты и 512 мкл (3.1 ммоль, 4 эквивалента по отношению к смоле)DIPEA в 3мл DCM, перемешивали в течениедвух часов при комнатнойтемпературе.
Смолу отфильтровывали и промывали 2×8 мл DCM в течениедвух минут.3. Далее в реактор добавляли 10 мл смеси DCM/метанол/DIPEA в соотношении17:2:1, перемешивали в течение 10 минут и отфильтровывали, даннуюоперацию проводили дважды, после чего смолу промывали DMF порциями по10 мл (3×2 мин).4. Деблокирование Fmoc-группы осуществляли описанным ранее способом.5. К смоле добавляли охлаждённый раствор 1 ммоль (2х кратный избыток)следующей защищенной аминокислоты, 184 мг (1.2 ммоль) HOBt и 187 мкл (1.2ммоль) DIC в 4 мл DMF, перемешивали в течение двух часов при комнатнойтемпературе, после чего смолу отфильтровывали и промывали DMF порциямипо 10 мл (7×2 мин).Операции 4, 5 повторяли до присоединения последнего аминокислотногоостатка.При одинаковой кратности избытков карбоксильной компоненты накаждой стадии использовалось одинаковое количество конденсирующихреагентов, поэтому, во избежание повторов, в таблицах, описывающих синтезпептидов, эти данные приводятся один раз.71Деблокирование Fmoc-группы проводили, дважды промывая смолу 20%раствором диэтиламина в DMF (5 и 20 мин).
Условия деблокирования,отличные от данных, указаны дополнительно.Два значения времени протекания реакции в таблицах означают, что впервом случае реакция прошла не полностью и была повторена с новымраствором реагентов.Синтез фрагмента 1-25 белка РВ1 последовательным наращиваниемпептидной цепиH-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-Thr6-Leu7-Leu8-Phe9-Leu10-Lys11-Val12-Pro13-Ala14Gln15-Asn16-Ala17-Ile18-Ser19-Thr20-Thr21-Phe22-Pro23-Tyr24-Thr25-OHПептид был синтезирован по описанной ранее общей методике, количествореагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 8.Таблица 8. Синтез фрагмента 1-25 белка РВ1№реагентыМ,ν,ммоль0.7753.10.61.21.441.441.21.21.21.21.21.21.21.21.21.21.82.162.161.81.81.81.81.81.8г/моль123456789101112131415161718192-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocThr(t-Bu)OHFmocTyr(t-Bu)OHDICHOBt*H2OFmocProOHFmocPheOHFmocThr(t-Bu)OHFmocThr(t-Bu)OHFmocSer(t-Bu)OHFmocIleOHFmocAlaOH*H2OFmocAsn(Trt)OHFmocGln(Trt)OHFmocAlaOH*H2OFmocProOHDICHOBt*H2OFmocValOHFmocLys(Boc)OHFmocLeuOHFmocPheOHFmocLeuOHFmocLeuOH129.2397.4459.6126.2153.1337.4387.4397.4397.4383.4353.4313.3596.7610.7313.3337.4126.2153.1339.4468.5353.4387.4353.4353.472m, мг/ V,мкл500401/512238552182/228221405465477477460424376716733376607273/337331611843636697636636t, ч22223224205161517193205162;1202122232425FmocThr(t-Bu)OHFmocProOHFmocAsn(Trt)OHFmocValOHFmocAsp(O-t-Bu)OHFmocMetOHНачинаясостатка397.4337.4596.7339.4411.5371.51.81.81.81.81.81.8аспарагина-16до7156071074611741669остатка5;1218;22615;241920метионина-1длядеблокирования Fmoc-группы смолу промывали 3 раза 20% растворомдиэтиламина в DMF (5, 20 и 10 мин).
В случае остатка аспарагиновой кислоты вположении 2 наряду с диэтиламином использовали DBU, как было описаноранее.На стадии финального деблокирования смолу перемешивали в течение 2.5часов с 8 мл смеси TFA:EDT:TIS:H2O (в объемном соотношении 92.5 : 2.5 : 2.5 :2.5), далее обрабатывали, как было описано ранее. Получено: 840 мг (50 %).После очистки пептида с помощью препаративной ВЭЖХ и последующейлиофилизации получено 361 мг (общий выход 22 %), чистота продукта поданным аналитической ВЭЖХ составила 96.3 %. HRMS (ESI+), m/z: 2781.4643([М+Н]+), рассчитано 2781.4532.Синтез фрагмента 1-25 белка РВ1 конвергентным способомH-Met1-Asp2-Val3-Asn4-Pro5-Thr6-Leu7-Leu8-Phe9-Leu10-Lys11-Val12-Pro13-Ala14Gln15-Asn16-Ala17-Ile18-Ser19-Thr20-Thr21-Phe22-Pro23-Tyr24-Thr25-OHРазбивка целевого соединения на фрагменты была проведена по остаткампролина в положениях 5 и 13, по описанным ранее методикам былисинтезированы и выделены защищенные фрагменты 1-5 и 6-13 (таблицы 9 и 10соответственно).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
