Диссертация (1150004), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Кроме того, белок NEPучаствует в регуляции транскрипции и трансляции вирусных белков [151, 152].2.3.8 РНК-полимеразаЭтот фермент вируса гриппа является гетеротримерным комплексом смассой 250 кДа, состоящим из трех белков: РА, РВ1 и РВ2. РНК-полимеразаиграет центральную роль в жизненном цикле вируса и непосредственноотвечает за синтез РНК. Полимераза вируса гриппа способна de novoреплицировать геномную РНК вируса в два шага. Первый шаг — репликация(вРНК — кРНК — вРНК) — заключается в синтезе комплементарной РНК(кРНК) на матрице вирусной РНК (вРНК), после чего происходит синтез вРНКскРНК-матрицы,чтозавершаетрепликациюгеномнойРНК.Шагтранскрипции (вРНК — мРНК) заключается в синтезе в транскрибированиимРНК с вРНК-матрицы с использованием кэпированных праймеров мРНК (кэпснэтчинг).
До сих пор не ясно, как регулируются все эти различные функции,осуществляемые одним большим белковым комплексом. Некоторые данныепозволяют предположить существование различных состояний комплекса,соответствующих разным конформациям, между которыми полимераза можетпереключаться, переходя из режима репликазы в режим транскриптазы и33обратно. Однако, согласно другим данным, вРНП, выделенных из вируса, былодостаточно для синтеза РНК обоих типов in vitro. Поэтому былосделанопредположение о том, что полимеразный комплекс способен одновременносинтезировать и мРНК, и кРНК [153].2.3.8.1 Структурная организация и функцииНа данный момент детальная структурная модель гетеротримерногокомплекса полимеразы вируса гриппа отсутствует, однако существуют моделина основе изображений с низким разрешением, полученные с помощьюэлектронной микроскопии, для полимеразы как в составе вРНП-комплекса сРНК и нуклеопротеином (NP), так и для изолированной полимеразы.
Нарисунке 9 приведена структура комплекса, реконструированная при помощиэлектронно-микроскопического анализа рекомбинантных белков, входящих вего состав.Рис. 9 Пространственная структура полимеразного комплекса вируса гриппа. А –растворимый тример, В, С – связанный с РНП [51].Гетеротример полимеразы плотно упакован с полой центральной частьюи без четких границ между субъединицами и доменами. Модели полимеразы всоставе вРНП и изолированного гетеротримера полимеразы имеют различныеконформации:полимераза,ассоциированнаясвРНПвыглядитболеекомпактной, чем изолированная полимераза, что позволяет предположить, что34при активации комплекс, возможно, претерпевает конформационные изменения[153].
Схема структурной организации полимеразного комплекса показана нарисунке 10.Рис. 10 Схема структурной организации РНК-полимеразы вируса гриппа. Косымилиниями показаны взаимодействующие участки субъединиц.Считается, что белок РВ1 является наиболее важным компонентомполимеразного комплекса и взаимодействует непосредственно с белками РА иРВ2. До сих пор не было свидетельств непосредственного контакта междубелками РА и РВ2 [154], однако есть данные, указывающие на то, что в клеткеони взаимодействуют, правда на три порядка слабее, чем при взаимодействиибелков РА-РВ1 или РВ1-РВ2. Функции различных субъединиц все ещевызывают разногласия, но для белков РВ1 и РВ2 они определены более четко[155].
РВ1 — главная белковаясубъединица для РНК-полимеразнойактивности; она связывается с вирусным промотором и отвечает за удлинениевирусной РНК и отщепление РНК-кэпа [156]. Субъединица РВ2 необходимадля транскрипции вРНК [155] и может связываться с метилированным кэпом-1хозяйских РНК для отщепления с помощью субъединицы РВ1 [157].
Гиллигэйисоавторамибылиопубликованы данные, демонстрирующиеосновысвязывания кэпа субъединицей РВ2 [158].Авторами [159] было идентифицировано соединение RO 0794238,которое является PB2-специфическим ингибитором связывания кэпа:35Вероятно, данное соединение связывается с минорным m7-карманом кэпсвязывающего сайта PB2.В работе [160] было показано, что соединение T-705 обладает высокойактивностью в отношении вируса гриппа, в том числе в отношении штаммов,устойчивых к ремантадину и оселтамивиру:Роль белка РА в полимеразном гетеротримере выяснена лишь частично.Есть сообщения о том, что он необходим для репликации и транскрипции РНК,а также для эндонуклеазного отщепления РНК-кэп-праймера [161, 162].Проведённый авторами [163] скрининг 33-х макроциклицеских соединенийпозволилидентифицироватьмарчантинЕвкачествеингибитораэндонуклеазной активности РА. Есть данные о том, что субъединица РА такжеиндуцирует протеолиз вирусных и хозяйских белков и, возможно, участвует всборке вируса [164, 165].Архитектура полимеразного комплекса интенсивно исследовалась сцелью определения минимального набора компонентов, необходимого длявирусной транскрипции или репликации.
Есть сообщения о том, что белок РВ2не требуется для репликации и одна лишь субъединица РВ1 способнасинтезировать РНК [166]. Было показано, что димер РВ1-РА синтезирует denovo транскрипт длиной в 53 нуклеотида с использованием вРНК-промотора,но не способен эффективно синтезировать РНК с кРНК-промотора [167].Однако другие исследователи [168], используя рекомбинантный белковыйкомплекс,продемонстрировали,чтотолькогетеротримерспособенсинтезировать динуклеотиды pppApG, а димеры РВ1-РВ2 или РВ1-РА неспособны осуществлять этот процесс, что согласуется с результатамипредыдущих исследований, в одном из которых показана необходимость белкаРВ2 для репликации [169, 170]. Точечная мутация в положении 510 белка РА,приводящая к нарушению синтеза вирусной мРНК, указывает на то, чтосубъединица РА также необходима для транскрипции [171].
Таким образом,36вероятнее всего, для эффективной транскрипции и репликации вируса гриппанеобходимы все три субъединицы.2.3.8.2 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РАКак было упомянуто выше, белки РА и РВ1 образуют стабильныйкомплекс, что было установлено в опытах на дрожжевых клетках с помощьютак называемого двухгибридного метода. Путем исследования связываниябелка РА и рекомбинантных белков РВ1, содержащих делеции в различныхположениях, было установлено, что для образования комплекса РВ1-РАдостаточно сегмента из первых 48 N-концевых аминокислотных остатков белкаРВ1 [172] (таблица 2).Таблица 2. Влияние положения делетированного участка белка РВ1 на связывание сбелком РА [172]белокGAL4PB1 мутантные белки с делециямиплазмидаPB1NΔM40pSGPB1/5΄NcoIPB1NΔK168pSGPB1/5΄AflIIpSGPB1/5΄AccIpSGPB1/5΄EcoRIpSGPB1961idmAfl/AccpSGPB1idm Sca/AflpSGPB1/5΄NcoIcpSGPB1idmBcl/BamPB1NΔY253PB1NΔE479PB1iΔ167/252PB1iΔ48/168PB1NΔM40cPB1iΔ324/655связывание белкаРА––––++–+В последующем с помощью двухгибридного метода удалось уточнитьразмер этого сегмента до первых N-25 концевых аминокислотных остатков.
Вэтой работе с помощью сайт-специфического мутагенеза были также полученыварианты белка РВ1, имеющие мутации в N-концевом участке, и путем оценкиихсвязыванияс белком РА были37выявлены 12 наиболееважныхаминокислотных остатка. Также было проанализировано влияние этих мутацийна жизнеспособность вируса, которая в большинстве случаев была значительноснижена [173].Дальнейшие работы были сосредоточены на оценке влияния пептидныхингибиторов на репликацию вируса в клеточной культуре. В одной из работиспользовался фрагмент 1-25 белка РВ1, синтезируемый в одной рамке считыванияс маркером – зеленым флуоресцентным белком, что кодировалось плазмидой,которой трансформировали клетки.
При заражении этих клеток вирусом гриппа Анаблюдали подавление вирусной репликации [174].В другой работе использовался более короткий N-концевой пептид,отличающийся от соответствующей последовательности вируса гриппа В только водном положении. Пептид был модифицирован с помощью Tat-пептида,позволяющего проникать в клетку.
Было показано, что исследуемое соединениеподавляет репликацию вируса гриппа А и В [175].С учетом этой информации две группы исследователей с помощью рентгеноструктурногоанализасоответствующихопределилибелков,структурыдемонстрирующиекомплексовфрагментоввзаимодействиемеждусубъединицами РА и РВ1. В первом исследовании были проанализированыклонированные С-концевой фрагмент РА, соответствующий остаткам 257-716штаммаА/goose/Guangdong/1/96(H5N1)иN-концевойфрагментРВ1,соответствующий остаткам 2-25 [176] (рисунок 11).Рис.
11 Доменная структура С-концевой части белка РА и положение N-концевогопептида РВ1 в комплексе с белком РА по Хе и соавт. (2008) [176].38Во втором исследовании были проанализированы клонированные Сконцевой фрагмент РА, соответствующий остаткам 239-716 штамма А/PuertoRico/8/1934 (H5N1) и N-концевой фрагмент РВ1, соответствующий остаткам 181 [177]. Структура была определена с разрешением 2,9 Å и 3,2 Åсоответственно.Пространственные структуры, полученные этими двумя группамиисследователей, демонстрируют сходный тип взаимодействия РА и РВ1.Исследованные фрагменты белка РА организованы в виде двух доменов:домена I (“brain”), состоящего из семи β-слоев, окруженных пятью α-спиралямии короткой 310-спиралью, и домена II (“mouth”), состоящий из семи β-слоев ивосьми α-спиралей (рисунок 11).
N-концевой фрагмент белка РВ1 (PB1N),включающий аминокислотные остатки 1-15, имеет спиральную конформацию ирасположен между четырьмя спиралями домена II белка РА, приблизительнопараллельно по отношению к ним, причем N-конец белка РВ1 направленвнутрь домена II субъединицы РА. Четыре α-спиральных сегмента белка РАобразуют гидрофобный карман, находящийся в тесном взаимодействии сфрагментом белка РВ1 посредством гидрофобных взаимодействий, водородныхсвязей и Ван-дер-Ваальсовых сил (рисунок 12).39Рис. 12 Пространственная структура комплекса С-концевого фрагмента белка РА иN-концевого фрагмента белка РВ1 на основе рентгеноструктурного анализа (слева,рисунки a) и b), модель гидрофобных контактов (вверху справа) и водородных связей(внизу справа) по Обаяши и соавт.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
