Диссертация (1150004), страница 2

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 2)

Ещё несколько лет назад пептидыобычно вводили подкожно, внутримышечно или внутривенно, чтобы препаратне подвергался действию ферментов, присутствующих в желудочно-кишечномтракте. Однако в течение последних лет появились новые технологии доставкипептидов, включая парентеральный путь с контролируемым высвобождением(подкожно, внутримышечно или внутривенно), доставку через слизистыеоболочки(назальныеспреи,ингаляции8илисублингвальныйприём),пероральный приём (вещества, способствующие проникновению; ингибиторыпротеаз или носители) и трансдермальный путь (пластыри) [15].В настоящее время ведутся разработки, направленные на увеличениеселективности и продолжительности пребывания пептидов в плазме крови.Ниже приведены стратегии химической оптимизации пептидов [9, 10, 12, 13, 17- 35]:Поиск минимальной активной последовательностиУпрощение и/или оптимизация структуры с помощью аланинового или D-сканов для устранения потенциальных сайтов ферментативного расщепления, атакжедляопределенияаминокислотныхостатков,вовлечённыхвовзаимодействие с интересующей мишенью.Циклизация пептидов различными способами, в том числе, черездисульфидный,гидразиновыйилилактамовыймостыдлясниженияконформационной гибкости линейных пептидов, уменьшения количестваводородныхсвязей,улучшениямембраннойпроницаемости,атакжеповышения их устойчивости к протеолизу эндо- и экзопептидазами.Присоединение структуро-индуцирующих зондов, вызывающих заданнуюконформацию пептидовЗаменааминокислотныхостатковнаD-аминокислоты,N-метил-α-аминокислоты или β-аминокислоты для повышения стабильности пептида вплазме (например, устойчивости к действию эндопептидаз) и/или увеличениясродства целевого соединения к мишени.Замещение амидной связи между двумя аминокислотными остатками сцелью повышения стабильности пептидной последовательности в организме:NH-амидное алкилирование, замена карбонильной группы пептидной связи,например, на метиленовую группу (восстановленная связь: –CH2–NH–), а такжеC(=S) (эндотиопептид, –C(=S)–NH–), или PO2H (фосфонамид, –P(=O)OH–NH–).Замена NH-группы амидной связи на атомы кислорода (депсипептид, –CO–O–), серы (сложный тиоэфир, –CO–S–) или на метиленовую группу (–CO–CH2–)9Блокирование N- и/или С-концов пептида, например, N-ацилированием, N-пироглутаматом, С-амидированием и т.

д. или присоединение углеводныхцепей(гликозилирование)дляповышениястабильностив плазме (вособенности устойчивости по отношению к действию экзопептидаз).Модификация целевого соединения с помощью ПЭГ-, ГЭК- или ПАС-илирования, а также липидизацииПЭГ-илирование представляет собой присоединение к целевой молекулеводорастворимого полимера полиэтиленгликоля (ПЭГ) с молекулярной массойот 2 до 40 кДа, что позволяет улучшить растворимость пептидов в воде,защитить их от воздействия протеаз [22].

Другим методом увеличениябиостабильностипептидовибелковявляетсяПАС-илирование–присоединение к целевой молекуле аминокислотной последовательности,включающей остатки пролина, аланина и серина (ПАС-последовательность),длина такой последовательности может составлять 100 и более остатков [33].Преимуществами данного подхода являются увеличение устойчивости кпротеазам плазмы при сохранении способности к расщеплению почечнымипротеазами, высокая растворимость, низкие показатели токсичности ииммуногенности [36].Помимо ПЭГ- и ПАС-илирования также стоит отметить метод ГЭКилирования, заключающийся в присоединении к белкам и пептидамгидроксиэтилкрахмала (ГЭК или HES).

Этот метод направлен на увеличениепоказателей биоустойчивости и биологической активности препаратов.Подход, основанный на липидизации, подразумевает ацилированиесоединенийжирнымикислотами.Липидизированныесоединениядемонстрируют более высокую аффинность к эндогенному транспортномубелку альбумину в кровотоке по сравнению с нелипидизированнымисоединениями. Это продлевает время удержания препарата в крови и снижаетпочечный и печёночный клиренс, давая возможность увеличивать временныеинтервалы между отдельными приёмами препарата [21].10Еще одним методом стабилизации пептидов является присоединениеструктуро-индуцирующихпептидов.Например,аминокислотнойзондов,шестьвызывающихостатковпоследовательностизаданнуюлизина,аналогаконформациюприсоединённыхэнкефалина,ксмоглистабилизировать его [27].Устойчивость пептидов к протеолизу можно повысить, включая ваминокислотную последовательность целевого соединения D-аминокислоты,так как природные ферменты ориентированы на белки и пептиды, состоящие изаминокислот L-формы [28].

В случае производных человеческого кальцитонинабыло показано, что замена остатка L-фенилаланина на соответствующую Dформу приводило к стабилизации этих пептидов в плазме крови по сравнению снативной формой [30].ВключениеваминокислотнуюпоследовательностьпептидовN-метилированных аминокислотных остатков позволяет повышать устойчивостьпептидов к действию пептидаз. Например, укороченные аналоги нейротензинапослемодификацииаминокислотнойпоследовательностиспомощьюметилированного аргинина или создания псевдопептидной связи проявлялибольшую устойчивость к протеазам плазмы, чем немодифицированныесоединения[31],какивслучаевведенияN-метилфенилаланинаваминокислотную последовательность аналогов человеческого кальцитонина[30].К повышению стабильности пептидов также приводит включение ваминокислотную последовательность целевого соединения β-аминокислот.

Вработе [32] было показано, что нонапептид, состоящий из β-аминокислот, вопытах на крысах не подвергался ферментативному расщеплению.Перспективным подходом для улучшения биологических характеристикпептидных препаратов является комбинация двух или более перечисленныхвыше методов [21]. Например, циклизация пептида и включение в егоаминокислотную последовательность D-аминокислот. Таким образом былмодифицирован гонадолиберин (гонадотропин высвобождающий гормон) декапептид, содержащий в аминокислотной последовательности D- и L11цистеин, который был циклизован через дисульфидный мост.

Добавлениемодифицированного соединения к тканевым гомогенатам, содержащимбольшое количество протеаз, показало пролонгированную устойчивостьпрепарата к действию ферментов по сравнению с линейным пептидом [37].Набор описанных выше подходов существенно расширяет возможностидля совершенствования как разрабатываемых, так и уже существующихпептидных и белковых лекарственных препаратов.2.2 Синтез пептидовВ общем случае наиболее подходящий метод для получения пептидаопределяется количеством аминокислотных звеньев, входящих в его состав.Возможно использование химического синтеза, технологии рекомбинантнойДНК или ферментативного синтеза.Первыми пептидами, полученными путём рекомбинантного синтеза,были соматостатин и инсулин в 1977 и 1978 годах соответственно [38-40].

Этотметод подходит для промышленного производства пептидов с длиной цепи от50 до 100 аминокислотных остатка. Одним из недостатков данной технологииявляется невозможность включения в аминокислотную последовательностьнеприродных аминокислотных остатков, а также получения пептидныхпроизводных, например, С-концевого амида пептида [9].Большинство фармацевтически значимых пептидов содержит до 50аминокислотных остатков, и для их промышленного получения наиболееподходит химический синтез, технологически более оправданный, чемметоды рекомбинантной ДНК или ферментативный синтез. Использование вхимическомсинтезенеприродныхаминокислот,атакжесозданиепсевдопептидных связей открывает возможности для получения большегоразнообразия соединений, чем доступно с помощью рекомбинантныхтехнологий [9].Химический синтез пептидов бывает классическим, проводимым врастворе,твердофазным,проводимымсиспользованиемполимерныхносителей, а также комбинированным.

В 1953 году дю Винье впервые12синтезировал классическим способом гормон окситоцин [41]. Достоинствамиэтого метода является легкость масштабирования, использование небольших, всравнении с твердофазным синтезом избытков реагентов,контролякачестваклассическийполучаемыхсинтезвпромежуточныхрастворепродолжаетвозможностьпродуктов.Поэтомуиспользоватьсядляпромышленного производства олигопептидов.

Так, например, дипептидныйзаменительсахарааспартам(метиловыйэфирN-(L-α-аспартил)-L-фенилаланина) в большинстве случаев синтезируется в растворе, как и рядингибиторов ангиотензин-конвертазы (каптоприл, эналаприл и рамиприл) [21].Основными недостатками классического синтеза пептидов являютсябольшие временные затраты, необходимые для синтеза целевого соединения.Кроме того, в ряде случаев промежуточные соединения имеют низкуюрастворимость в подходящих для синтеза растворителях [21].

Для преодоленияперечисленных ограничений требовались альтернативные подходы.Таким подходом стал твердофазный синтез пептидов, разработанныйМеррифилдом в 1963 [42]. Особенностью метода является использование длясинтеза полистирольной смолы с присоединенным линкером, к которомуприсоединяется первый аминокислотный остаток. Растущая пептидная цепьостаётся ковалентно связанной с полимерным носителем до конца синтеза. Накаждомэтапесинтезаиспользуетсяизбытокреагентов,которыйотфильтровывается от полимерного носителя после завершения каждой стадии.После завершения синтеза пептид отщепляется от полимерного носителя.В твердофазном синтезе применяются Fmoc/t-Bu- и Boc/Bzl-стратегии,последняя в настоящее время используется все реже в силу следующихограничений: Для отщепления пептида от полимерного носителя требуются HF или TFMS. При удалении временной Вос-группы под действием TFA или растворов HClпостоянные защитные группы боковых цепей аминокислот (Z-, Bzl-)частично удаляются, так как не обладают необходимой стабильностью вданных условиях [43].13На рисунке 1 приведена общая схема твердофазного синтеза пептидов сиспользованием Fmoc/t-Bu-стратегии и 2-хлортритилхлоридной смолы [44].Рис.

Характеристики

Список файлов диссертации