Диссертация (1150004), страница 5
Текст из файла (страница 5)
Развитие резистентностивируса гриппа к арбидолу связано с мутациями гемагглютинина на границемежду субъединицами НА1 и НА2 [89].2.3.2 Нейраминидаза (NA)Поверхностный гликопротеин NA представляет собой тетрамер иотвечает за высвобождение частиц вирусного потомства, отщепляя сиаловуюкислоту рецепторов гемагглютинина на поверхности клеток [90], а такжеобеспечивает подвижность вируса в респираторном тракте [91]. Девятьподтипов NA можно разделить на две группы [92]: группу 1, состоящую из N1,N4, N5 и N8 подтипов; и группу 2, состоящую из N2, N3, N6, N7 и N9 подтипов.Определение структуры нейраминидаз группы 1 в 2006 году показало[92], что в противоположность нейраминидазам группы 2 петля-150 (остатки147-152) принимает открытую конформацию в апо-форме, открывающейприлегающуюкконфигурационнаяактивномугибкостьцентруполость.петли-150былаТакжезначительнаяпродемонстрированасиспользованием методов молекулярной динамики [93, 94].
Полость-150обеспечивает возможности для разработки N1-селективных ингибиторов. Этивозможностибылииспользованы25внесколькихисследованиях,задействовавших расчетные методы [95-100]. Рудравар и соавторы [100] впоисках активных производных отталкивались от N-ацетилнейраминовойкислоты, содержащей двойную связь в положении 2 (Neu5Ac2en). Производныеданного соединения, содержащие аллильные и арилаллильные заместители вположении 3 селективно ингибировали нейраминидазы группы 1 по сравнениюс нейраминидазами группы 2 и были одинаково эффективны противнейраминидаз дикого типа и мутантов His274Tyr.
В соответствии с даннымиавторов[100],заместителидействительнозанимаютполость-150вкристаллических структурах комплексов NA-ингибиторов.На основе структур нейраминидаз подтипов N2 и N9 [101, 102] былиразработаны два ингибитора [103, 104] – занамивир и осельтамивир,применяемые в настоящее время для лечения гриппа (рисунок 3):занамивиросельтамивирРис. 3 Ингибиторы нейраминидазы – занамивир и осельтамивир.Впоследствии были разработаны и другие ингибиторы нейраминидазы[105-108] (рисунок 4).А315675перамивирланинамивирРис. 4 Ингибиторы нейраминидазы - А315675, перамивир и ланинамивир (R-125489).26Проблема формирования резистентности вируса гриппа к ингибиторамнейраминидазы не теряет актуальности. Так, в эпидсезон 2008-2009 гг в 30странах мира были обнаружены штаммы вируса гриппа подтипа H1N1, 95%которых были устойчивы к осельтамивиру.
В России доля осельтамивирустойчивых штаммов нарастала с 2005 года и достигла максимума (91%) вэпидсезон 2008-2009 гг, однако с марта 2009 года этот подтип вируса былвытеснен вирусом гриппа A(H1N1)pdm09, чувствительным к осельтамивиру.На сегодняшний день доля осельтамивир-устойчивых штаммов не превышает1%. Осельтамивир, в отличие от занамивира, более эффективен для вирусовгриппа с N1, N4, N5, N8 подтипами нейраминидазы, в то время как занамивирболее эффективен для N2, N3, N6, N7 и N9 подтипов нейраминидаз [89].Наиболее известными мутациями вируса гриппа, приводящими кустойчивостикосельтамивиру,являютсяНis274TyrиArg292Lysвнейраминидазах подтипа 1 и 2 соответственно [109]. Вирусы, имеющие одну изуказанныхмутаций,чувствительныкА315675,чувствительны к перамивиру [109]. МутациянолишьчастичноArg292Lys также придаётчастичную устойчивость к занамивиру [109, 110], использование которогоприводит к появлению мутации Arg152Lys [89].2.3.3 Протонный канал М2Белок М2 образует протонный канал в вирусной мембране, которыйнеобходим для снижения значения рН внутри вирусных частиц послепопадания их в эндосомы.
Таким образом запускаются конформационныеизменения в гемагглютинине, приводящие к слиянию вирусной оболочки смембраной эндосомы. Белок М2 представляет собой тетрамер,каждыймономер которого имеет 97 аминокислотных остатков. 25 N-концевыхаминокислотных остатков являются внешними по отношению к вирусноймембране; следующие 21 аминокислотный остаток образуют одинарнуютрансмембранную спираль, за которой следует амфипатическая спираль из 16аминокислотных остатков, которая находится на поверхности раздела вирусноймембраны [111]; 35 С-концевых аминокислотных остатка находятся внутри27вируса.
Амфипатическая спираль связана с отпочковыванием вируса [112], а Сконцевой сегмент вовлечён в связывание с белком М1 [113].Домен проводимости белка М2 содержит окружающий пору кластерHis37-Trp41 (H37-W41) (рисунок 5). Остаток гистидина в положении 37отвечает как за активацию канала [114], так и за протонную селективность[115], тогда как остаток триптофана в положении 41 является ”воротами”канала, препятствуя прохождению тока протонов наружу [116].Рис. 5 Домен проводимости белка М2, содержащий связанный амантадин (показанрозовым). Желтым окрашена область, соответствующая вирусной мембране [117].Поскольку кластер H37-W41 играет важную функциональную роль, онпредставляется многообещающей мишенью для разработки ингибиторов,устойчивых к вирусным мутациям [117].БелокМ2являетсямишеньюдлялекарственныхпрепаратовадамантанового ряда - амантадина и ремантадина (рисунок 6):амантадинремантадинРис.
6 Ингибиторы белка М2 – амантадин и ремантадин.Амантадин разрабатывался для лечения болезни Паркинсона, однако входе клинических испытаний была обнаружена активность препарата в28отношении вируса гриппа [118], после чего амантадин стали использовать дляпрофилактики и лечения гриппа А. Амантадин и ремантадин одобреныамериканским управлением FDA для лечения гриппа, в России для этих целейприменяется ремантадин, тогда как амантадин - преимущественно для леченияболезни Паркинсона. Стоит отметить, что препараты адамантанового ряданеэффективны против гриппа В, поскольку этот тип вируса имеет другой белок(NB), аналогичный белку М2, но не содержащий адамантан-связывающегосайта.Амантадин и ремантадин блокируют ионный канал, связываясь с темсайтом в поре канала, в котором обнаруживаются мутации, приводящие кразвитию резистентности вируса к данным препаратам [111, 119-123].В поиске ингибиторов мутантных белков М2 исследователи [124-127]опирались на структуру амантадина, в результате чего были обнаружены болееэффективные ингибиторы белка М2 дикого типа, чем амантадин, однако этисоединения оказались неэффективными против мутантов, устойчивых камантадину.Авторами [128] был предложен новый ингибитор белка М2 - соединениеBL1743:Исследователям [129-132] удалось разработать эффективные ингибиторыбелков М2, имеющих мутации Val27Ala и Leu26Phe.
Одно из таких соединенийприведено ниже [131]:2.3.4 Нуклеопротеин (NP)Белок NP является тримером, контакты трех субъединиц (А, В и С)показаны на рисунке 7. Основная функция нуклеопротеина – заключать вкапсид сегментированную РНК и связываться с тремя субъединицами РНК29полимеразыдлятого,чтобыобразоватьрибонуклеопротеин(РНП),необходимый для транскрипции, репликации и упаковки РНК [133]. В каждомРНП вирусная РНК обёрнута вокруг собственной молекулы NP, которыесвязаны следующим образом: "хвостовая петля" (tail loop) (остатки 402-428)одной молекулы NP (498 остатков) спрятана внутри соседней молекулы NP[134, 135].
Частицы РНП связываются с белком М1 для экспорта из ядраклетки-хозяина [136].Рис. 7 Межсубъединичные контакты белка NP. Субъединицы А, В и С показанызеленым, красным и желтым цветами соответственно [134].Авторами [137] было обнаружено, что нуклеозин вызывает агрегациюнуклеопротеина и ингибирует вирусную репликацию:Карман, связывающий домен хвостовой петли (tail-loop binding pocket) вбелке NP, а также РНК-связывающая бороздка (RNA binding groove) являютсямишенями для рационального поиска лекарств(рисунок 8) [117]. Былоустановлено, что олигомеризация NP, опосредованная связыванием хвостпетля, играет важную роль в траскрипционной и репликационной активности30частиц РНП, а ионные взаимодействия между остатком глутаминовой кислотыв положении 339 и остатком аргинина в положении 416 важны для связыванияхвостовой петли [138].Рис. 8 Структура мономера белка NP с хвостовой петлей (показана красным).
Ионныевзаимодействия, важные для связывания хвост-петля, показаны на врезке [117].Авторами [139] был обнаружен ингибитор олигомеризации белка NP,способный подавлять вирусную репликацию у штаммов не только дикого типа,но и устойчивых к нуклеозину:Федичевым и соавторами [140] был предложен потенциальный блокатор(binder)нуклеопротеина, воздействующий, согласно расчетным данным, наРНК-связывающую бороздку:Данное соединение ингибировало репликацию вируса гриппа А как in vitro, таки in vivo.312.3.5 Белки М1 и М42Матричный белок 1 (М1) содержит 252 аминокислотных остатка иявляется важным структурным элементом частиц вируса гриппа А.
В вирионеМ1 образует промежуточный слой между связанными с мембраной НА, NA иМ2 белками и восемью частицами РНП. В ядре заражённых клеток связываниеМ1 с вновь собранными частицами РНП играет важную роль в их экспорте[141]. М1 также важен при отпочковывании вируса [142].Аминокислотные остатки 1-67 и 89-164 образуют пучок (bundle) изчетырёх спиралей, которые укладываются в стопку друг за другом, линкермежду ними также содержит короткую спираль [143, 144].
Структура Сконцевого участка не установлена, однако известно, что в ней содержитсязначительное число спиралей [144]. Средний домен содержит мотив101ArgLysLeuLysArg105, который является клеточным сигналом внутриядернойлокализации, и играет важную роль в импорте М1 в ядро заражённых клеток[145]. Этот основной мотив также вовлечён в связывание М1 с NEP [146].Белок М42 длиннее белка М2 на два аминокислотных остатка иидентичен ему, начиная с десятого аминокислотного остатка. Известно, чтобелок М42 обладает всеми основными функциями белка М2 и отличается, покрайней мере, по антигенным свойствам за счет первых девяти остатков,специфичных для М42 [75].2.3.6 Неструктурный белок 1 (NS1)Основные функции NS1 – подавление иммунного ответа организма,связанного с выделением зараженными клетками интерферона [147], а такжерегуляция синтеза вирусной РНК.
В зависимости от штамма NS1 состоит из 230или 237 аминокислотных остатков и образует димер. Его можно разделить надва функциональных домена: N-концевой домен (остатки 1-73), которыйсвязывает двунитевую РНК [148], и С-концевой эффекторный домен (effectordomain) (остатки 74-230/7), который связывает множество клеточных белков[147], включая CPSF30 – белок, необходимый для обработки 3'-конца всехклеточныхпре-мРНК[149].Авторы32[150]идентифицироваличетыресоединения, способных ингибировать NS1, но при этом не было установленосайтов связывания с этим белком.2.3.7 Белок ядерного экспорта (NEP или NS2)Данный белок содержит 121 аминокислотный остаток, первые десятьостатков которого идентичнытаковым в белке NS1.
Белок NEP являетсявторым белком-адаптором между частицами РНП и клеточным белком Crm1,который опосредует ядерный экспорт многих белков, содержащих богатыйлейцином сигнал ядерного экспорта (NES, nuclear export signal) [146]. Nконцевой участок (остатки 1-54) NEP несёт мотив NES и связывает белокCrm1. С-концевой участок (остатки 63-116) имеет форму спиралевиднойшпильки. Было установлено, что остаток триптофана в положении 78 играетключевую роль для сайта связывания белка М1.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
