Диссертация (1150004), страница 7
Текст из файла (страница 7)
(2008) [177].Согласно полученным пространственным структурам, короткий мотивLeuLeuPheLeu, включающий аминокислотные остатки 7-10 белка PB1,взаимодействует с гидрофобным кором С-концевого фрагмента белка РА,который образован аминокислотными остатками Phe411, Met595, Leu666,Trp706, Phe710 и Leu640. Кроме того, посредством водородных связей остатокTrp706 белка РА контактирует с остатками Val3 и Asn4 белка PB1, остаткиGln408 и Asn412 белка РА контактируют с остатками Val3 и Asp2 белка PB1, аостаток Gln670- с остатками Phe9, Val12, Pro13 и Ala14 белка PB1 (рисунок13). Двойные мутации белка РА в положениях Trp706Ala/Gln670Ala,Leu666Gly/Phe710Glu, Leu666Gly/Phe710Gly и Trp706Ala/Phe710Gln нарушаютсвязывание N-концевого фрагмента белка PB1 с С-концевым фрагментом белкаРА.40Рис.
13 Схема водородных связей между аминокислотными остатками С-концевогофрагмента белка РА и N-концевого фрагмента белка PB1 [178].В работе Вундерлиха и соавторов была проведена детальная оценказначимости каждого из первых 15 N-концевых аминокислотных остатка белкаРВ1 для связывания с белком РА, а также были выявлены замены,увеличивающие связывание с белком РА.
В результате было выяснено, чтопомимо кора 5-11 для связывания in vitro с белком РА важны также остатки 1,3, 12, 14 и 15 [179]. Ключевая роль кора 5-11 подтверждается также данными поколичественной оценке взаимодействия серии N-концевых фрагментов белкаРВ1 с белком РА [175].2.3.8.3 Перспективы разработки противовирусных средствN-концевой фрагмент белка PB1 ингибирует репликацию вируса гриппаА, подавляя полимеразную активность [174], вероятнее всего, за счетблокирования сборки полимеразного гетеротримера.
Данные о структуре Сконцевого фрагмента белка РА позволяют определить участок, отвечающий засвязывание с белком РВ1, и поэтому могут быть использованы как основа дляразработки новых соединений, подавляющих сборку и активность РНКполимеразы. Обычно в белок-белковых контактах задействована большая41площадь поверхности, что создает проблемы для разработки новых лекарств.Однако в данном случае в образовании связей между белками РВ1 и РАучаствует относительно небольшое число аминокислотных остатков, что делаетосуществимым дизайн малых молекул-ингибиторов этого взаимодействия.Было показано, что замена определенных аминокислотных остатков в Nконцевой части белка PB1, включая остатки Val3, Asn4, Leu7, Leu8, Pro5, Phe9и Leu10, приводит к снижению эффективности связывания более чем на дветрети со значительным уменьшением полимеразной активности и репликациивируса.
Мутации Asp2Val и Ala14Asp в белке PB1 не снижают значительносродство этого пептида к белку РА, но подавляют полимеразную активность ивирусную репродукцию, что указывает на то, что у этих аминокислотныхостатков есть другие важные функции. Мутация Leu13Pro в белке РВ1 вирусасубтипа Н7N7 связана с повышенной вирулентностью [180]. Согласноструктурным данным, заменаостатка лейцина на пролин в положении 13должна нарушить целостность спирали, и связанные с этим структурныеизменения могут привести к увеличению эффективности синтеза РНКсубъединицей РВ1. Аминокислотные остатки N-концевой части белка PB1,взаимодействующие с белком РА, консервативны во всей группе типов вирусагриппа А, В и С, как и аминокислотные остатки белка РА, взаимодействующиес белком PB1, настолько же консервативны.
Поэтому предполагается, чтоингибирующие пептиды или другие соединения, разработанные на основеаминокислотной последовательности N-концевой части белка PB1 будутэффективны в отношении большинства штаммов вируса гриппа А. Кроме того,высокая консервативность PB1N-связывающего сайта белка РА предполагаетто, что противовирусные препараты, нацеленные на этот сайт, будут меньшеподвержены проблемам формирования устойчивости к ним, которые создаюттрудности в применении лекарственных средств, направленных противнейраминидазы.Как уже упоминалось, синтетические пептиды, разработанные на основеPB1N, показали высокое сродство к С-концевому фрагменту белка РА in vitro испособны блокировать образование функционального комплекса белков РА и42РВ1.
Однако при этом проблема проникновения в клетку решалась либо за счеттрансформации клеток соответствующей генетической конструкцией, чтонеприемлемо при терапевтическом использовании, либо за счет добавлениядополнительнойаминокислотнойпоследовательности,способствующейпроникновению в клетку. Это делает актуальным проверку ингибирующихсвойств пептидов по отношению к репликации вируса на клеточных культурах,помимо оценки связывания с РА in vitro. Кроме того, нельзя считатьзаконченнымпоископтимальнойаминокислотнойпоследовательностиингибирующего полимеразу пептида, которая должна оптимально сочетать всебе связывание с белком-мишенью, способность проникать в клетку сминимумом модификаций, а также приемлемую длину. Ввиду вышеуказанныхпричин представляется перспективным направление исследований, ставящихсвоей целью разработку противогриппозных средств, направленных наспецифическое подавление сборки вирусной РНК-полимеразы.2.3.8.4 Взаимодействие субъединиц РВ1 и РВ2Для начала синтеза мРНК вируса гриппа необходимо предварительноеотщепление от хозяйской пре-мРНК олигонуклеотида, содержащего 5’-кэп –процесс, получивший название кэп-снэтчинг (cap snatching).
Олигонуклеотидзатем удлиняется с использованием вирусной РНК в качестве матрицы.Ключевым событием в инициации синтеза вирусной мРНК являетсяобразование комплекса между РНК-связывающей субъединицей полимеразыРВ1 и кэп-связывающей субъединицей РВ2 [181]. При этом со стороны однойиз субъединиц во взаимодействии участвует короткий N-концевой участок - также, как и в случае взаимодействия белков РВ1 и РА [176, 177] (рисунок 14). Иточно так же это открывает возможности для ингибирования взаимодействияпосредством низкомолекулярных соединений, в частности, пептидов [182].43Рис. 14 Схема расположения функциональных доменов и участков взаимодействиясубъединиц полимеразы вируса гриппа.
Черным отмечены остатки, определяющиеспецифичность к хозяину. Также отмечены мотивы pre-A, B, C, D и Е полимеразногодомена субъединицы РВ1 [181].Несмотрянато,чтопервыеисследованиясиспользованиемиммунопреципитации и введением делеций указывали на наличие двухконтактов между субъединицами РВ2 и РВ1 [154], в последних работахдостоверно показано наличие одного такого контакта; прочие участкивзаимодействия, если имеются, то играют второстепенную роль [182, 183]. Так,опыты с использованием копреципитации показали, что стабильный комплексобразуется между 86 С-концевыми аминокислотными остатками субъединицыРВ1 (678-757) и 37 N-терминальными остатками РВ2 (1-37) [183].
При этомсравнение аминокислотных последовательностей различных штаммов, вчастности, птичьих и человеческих, демонстрирует, что эти участки являютсявысококонсервативными [182].44Рентгеноструктурный анализ кристаллов комплекса соответствующихфрагментов белков РВ1 и РВ2 выявил, что каждый из этих фрагментоворганизован в виде трех α-спиралей. В отличие от контакта субъединиц РВ1 иРА, где главную роль играют гидрофобные взаимодействия [176, 177], вовзаимодействии белков РВ1 и РВ2 преобладают водородные связи и ионныевзаимодействия [182]. Со стороны белка РВ2 почти все аминокислотныеостатки, взаимодействующие с белком РВ1, сосредоточены в N-концевой αспирали, которая соответствует аминокислотным остаткам 1-12 (рисунок 15).Рис.
15 Схема взаимодействия субъединиц РВ1 и РВ2 полимеразы вируса гриппа суказанием аминокислотных остатков, предположительно образующих контакты[182].Анализ мутантов показал, что замены остатков лейцина в положении 7 вбелке РВ2, и, в несколько меньшей степени, изолейцина в положении 4 нааспарагиновую кислоту, а также двойные мутацииIle4Ser/Leu7Ser иLeu7Ser/Leu10Ser заметно подавляют связывание С-концевого фрагмента РВ1 с45N-концевым фрагментом РВ2 и синтез вирусной мРНК, что свидетельствует оважности остатков Ile-4, Leu-10 и, в особенности, Leu-7 субъединицы РВ2.Ключевая роль остаткаLeu-7 субъединицы РВ2 подтверждаетсяегонепосредственной близостью с остатками Phe-699 и Leu-715 белка РВ1 висследованномкомплексе,чтоуказываетнавозможноегидрофобноевзаимодействие между ними [182].
С другой стороны, замены в участкевзаимодействия субъединицы РВ1 имеют менее однозначный эффект. Так,двойные мутации Val715Ser/Ile750Ser и Ile746Ser/Ile750Ser подавляют синтезвирусной мРНК, хоть в меньшей степени, чем вышеупомянутые мутации в Nконцевой части РВ2. Мутация Leu695Asp также снижает активностьполимеразы, но очень незначительно. Однако мутации Ile750Asp и Phe699Alaослабляют связь между С-концевым фрагментом РВ1 и N-концевымфрагментом РВ2, но повышают активность полимеразы.
Напротив, мутацияVal715Ser,сохраняявзаимодействиемеждусубъединицами,снижаетактивность полимеразы [182]. Результаты анализа указанных аминокислотныхзамен в C-концевой области белка РВ1 свидетельствуют о том, что контактсубъединиц РВ1 и РВ2 является не просто местом прикрепления однойсубъединицы к другой, а играет более сложную регуляторную роль, обладаяструктурной и функциональной гибкостью. Это необходимо учитывать присоздании ингибиторов взаимодействия этих двух субъединиц. Тем не менее, сучетом компактности области контакта и консервативности соответствующейаминокислотной последовательности участки взаимодействия субъединиц РВ1и РВ2 сохраняют перспективность как мишень для противовирусныхпрепаратов.2.3.9 Белки PB1-F2 и PB1-F3 (N40)Также, как и белок РВ1, данные белки кодируются сегментом 2вирусного генома.
Белок PB1-F2, содержащий 87-90 аминокислотных остатков,образуется при начале трансляции с альтернативного старт-кодона и в другойрамке считывания, нежели белок PB1 и локализуется в митохондриальныхмембранах. Функции PB1-F2 разнообразны и включают, по крайней мере, у46изученных вирусных штаммов, активацию апоптоза, а также регуляциюинтерферонового ответа организма на вирусную инфекцию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
