Диссертация (1150004), страница 3
Текст из файла (страница 3)
1 Схема твердофазного синтеза пептидов с использованием Fmoc/t-Bu-стратегии.Использование 2-хлортритилхлоридной смолы дает возможность получатьпептиды с С-концевой карбоксильной группой. Для получения амидовпептидов можно использовать смолу Ринка [45]:14Твердофазныйконвергентным.синтезпептидовПоследовательныйбываетсинтезпоследовательнымпредполагаетипоэтапноеприсоединение аминокислотных остатков до тех пор, пока необходимаяаминокислотная последовательность не будет получена.
В общем случаетаким способом получают пептиды, содержащие до 15 аминокислотныхостатков. Для конвергентного синтеза аминокислотную последовательностьцелевого соединения разбивают на фрагменты, конденсация которых можетбыть проведена как твердофазно, так и в растворе. В последнем случае синтезназывается комбинированным. Такой подход позволяет сократить общеевремясинтезаиснизитьстоимостьцелевогосоединениязасчетиспользования меньших избытков реагентов при конденсации фрагментов,чем в случае твердофазной конденсации [46]. Комбинированный подход былиспользован в синтезе ингибитора слияния ВИЧ -препарата энфувиртид,аминокислотная последовательность которого была разбита на три фрагмента споследующей конденсацией в растворе [47].Достоинствамиавтоматизациитвердофазногопроцесса,синтезаотсутствиеявляютсянеобходимостивозможностьвыделенияпромежуточных соединений и низкие временные затраты (в сравнении ссинтезом в растворе), необходимые для получения целевого соединения.
Насегодняшний день использование этого метода для получения терапевтическихпептидов является оптимальным [48].Для конвергентного синтеза пептидов используются защищенныефрагменты целевого соединения, в то время как использование методанативной химической лигации (NCL) позволяет осуществлять конденсациинезащищенных фрагментов целевого соединения [49], механизм этого процессаприведен на рисунке 2 [21].15Рис. 2 Механизм нативной химической лигации. Меркапто-группа N-концевогоостатка цистеина C-концевого фрагмента целевого пептида обратимо реагирует с Cконцевым тиоэфиром N-концевого фрагмента пептида. Последующий S-N-ацильныйсдвиг приводит к образованию целевого соединения, содержащего нативнуюпептидную связь [50].Преимущество этого метода заключается в высокой эффективностиреакции конденсации, а также чистоте целевого соединения по сравнению споследовательным твердофазным синтезом.2.3 Вирусные белки – потенциальные лекарственные мишениВ функционировании различных вирусных ферментов важную рольиграют белок-белковые взаимодействия (ББВ).
Так, например, РНК-полимеразавируса гриппа представляет собой комплекс из трех белков [51]. Помимонизкомолекулярных веществ-посредников ББВ задействованы в регулированиимногочисленных клеточных процессов, в том числе, в передаче клеточныхсигналов.ОсобенностямиББВявляютсяслабыенековалентныеиндивидуальные контакты, временный характер связей, большое числововлеченныхатомов,разнообразиехимическихгрупп,ограниченноеразнообразием стандартных аминокислот и ряда их производных, но при этомвысокая специфичность.
Именно высокая специфичность взаимодействий при16относительном химическом однообразии делает сложным поиск соединениймодификаторов ББВ [21, 52]. Разработка ингибиторов и, в общем случае,модификаторов ББВ, важна для контроля и регулирования этих процессов.Такие соединения могут быть как полезным инструментом в исследовательскойработе, так и потенциальными терапевтическими агентами [21, 53, 54].Участки взаимодействия белков друг с другом обычно представляютсобой непрерывные мотивы длиной примерно 8-24 аминокислотных остаткаили несколько коротких участков, разнесенных по длине полипептидной цепи исближенных в пространстве.
Таким образом, белковая поверхность может бытькартирована в виде сегментов вдоль цепи, вместе формирующих сайтсвязывания. Наличие достаточно протяженных сегментов может предполагатьвозможность использования соответствующих пептидов для имитации участкасвязывания белковой молекулы с молекулой-партнёром. Синтетический пептидможет затем быть использован для ингибирования связывания этих двухмолекул. Способность пептидных фрагментов эффективно воспроизводитьконформацию и электронные свойства функциональных нативных эпитоповполноразмерных белковых молекул была продемонстрирована в случае SH3доменов [55, 56].Пептиды-фрагментывзаимодействующихбелковмогубытькакингибиторами дальнейшей передачи сигнала посредством ББВ, так иактиваторами, часто незначительно отличаясь друг от друга.
Кроме того,подобные пептиды могут избирательно связываться с определенной изоформойбелка, например, протеинкиназы С. Избирательное подавление или активацияфункции какой-либо из изоформ позволяет выяснить роль этой изоформы, чтоважно для последующей разработки лекарственных препаратов. Известно, чтодействие различных изоформ может быть клинически прямо противоположным[57], что предъявляет высокие требования при выборе изоформы-мишени и впоследствии при создании высокоселективного лекарственного средства.Пептидные модификаторы ББВ являются важным инструментом дляисследования взаимодействия белков.
Иногда аминокислотные замены впептиде не отменяют связывания с белком-мишенью, но приводят к17исчезновениюфизиологическогоэффектаполноразмерногобелка(ипептидного фрагмента без замен) в опытах in vivo [58].При поиске участков в белке-мишени, которые могут быть использованыдля выбора аминокислотных последовательностей пептидных модификаторовББВ, необходимо знать, с какими белками он взаимодействует. Это можносделать с использованием как экспериментальных, так и теоретическихподходов, in silico [59].В общем случае, для поиска белка, взаимодействующего с даннымбелком, можно использовать следующие методы: метод двухгибриднойсистемы (two-hybrid system), создание и анализ фаговой дисплей-библиотеки(phage display library), очистку с тандемной аффинностью (tandem affinitypurification, TAP), поперечную химическую сшивку (chemical cross-linking) илииммунокопреципитацию(co-immuniprecipitation).Эти методыпозволяютцеленаправленно находить белки, связывающиеся с выбранным белкоммишенью.
Часто исследователи не ограничиваются одним методом ииспользуют второй для подтверждения первоначальных результатов. Крометого,существуютметоды,применяемыенедляобнаружения,апреимущественно для подтверждения или детального анализа взаимодействиябелков:например,бимолекулярнаякомплементацияфлуоресценции(bimolecular fluorescence complementation, BiFC) и поверхностный плазмонныйрезонанс (surface plasmon resonance, SPR) [60-62].Кроме того, для организмов, геном которых расшифрован полностью илив значительной степени, возможен поиск ББВ по гомологии с уже известнымиобразующими комплекс белками. Такие масштабно проводимые исследования,называемыефункциональнойпротеомикой,привеликкартированиюзначительной части белковых интерактомов нескольких вирусов, бактерий, атакжепарэукариотическийхозяин-вирус,частичнопроверенныхэкспериментально. Такие интерактомы могут помочь выбрать для дальнейшегоисследования партнер белка-мишени из всех или большей части возможных вусловиях клетки вариантов [63, 64].18С помощью вышеупомянутых экспериментальных методов, а такжеанализа гомологичных белков, можно определить непосредственный участоквзаимодействия белка с белком-партнером.
Исследование in vitro связыванияодного из белков с различными синтетическими пептидами-фрагментамиучастка взаимодействия белка-партнера позволяет уточнить размеры сайтасвязыванияиопределитьаминокислотныеостатки,критическиедлясвязывания. Значимость каждого из аминокислотных остатков можно оценить,в частности, путем синтеза серии пептидов с последовательными заменамиаминокислотных остатков,например, на остаток аланина, и сравнения ихсвойств со свойствами пептидов «дикого типа», то есть без замен. Кроме того,такможновыяснить,насколькопротяженныеучасткиобразованыкритическими для связывания аминокислотными остатками.Внастоящеевремяимеютсябазыданныхаминокислотныхпоследовательностей белков, а также большое количество экспериментальныхданных по белкам из различных гомологичных групп, что позволяет сократитьэкспериментальную фазу поиска участков белков, перспективных в планесозданияпептидныхмодификаторовББВ.Поискпоследовательностей можно осуществлять путемтакихкороткихскрининга большихбиблиотек с использованием системных или статистических методов, а такжерационального подхода [65, 66].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
