Диссертация (1150004), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Синтез защищенного фрагмента 14-20№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocAsp(O-t-Bu)OHFmocTyr(t-Bu)OHDICHOBt*H2O2М,г/мольν, ммоль0.391.550.20.40.480.48129.2411.5459.6126.2153.188m, мг/ V,мкл250200/2568218461/7574t, ч2234567FmocThr(t-Bu)OHFmocGln(Trt)OHFmocArg(Pbf)OHFmocGlyOHFmocGln(Trt)OHПоследеблокирования397.4610.7648.8297.4610.70.40.40.40.40.4Fmoc-группызащищенный15924426011924423323фрагмент14-20использовали для дальнейших реакций, не отщепляя от полимерного носителя.Синтез защищенного фрагмента 6-20 конденсацией фрагментов 6-13 и 14-20H-Gln(Trt)-Thr(t-Bu)-Arg(Pbf)-Met-Asp(O-tBu)-Lys(Boc)-Leu-Thr(t-Bu)-Gln(Trt)Gly-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Thr(t-Bu)-Tyr(t-Bu)-Asp(O-tBu)-OHК смоле, содержащей 0.2 ммоль фрагмента 14-20 был добавленпредварительно охлажденный раствор 1.13 г (0.58 ммоль) защищенногофрагмента 6-13, 0.16 г (1.17 ммоль) HOAt и 0.18 мл (1.17 ммоль) DIC в 10 млDMF.
Реакционную смесь перемешивали в течение 7 суток. Контроль за ходомреакции осуществляли каждые 2 суток с помощью теста Кайзера на свободныеаминогруппы. После завершения реакции смола была отфильтрована и промыта7х10 мл DMF, деблокирование Fmoc-группы осуществляли описанным ранееспособом. Полученный фрагмент 6-20, не выделяя, использовали длядальнейших реакций.Получение целевого соединения - конденсация фрагментов 6-20 и 1-5К смоле, содержащей 0.20 ммоль фрагмента 6-20 был добавленпредварительно охлажденный раствор 685 мг (0.6 ммоль) защищенногофрагмента 1-5, 245 мг (1.8 ммоль) HOAt и 280 мкл (1.8 ммоль) DIC в 10 млDMF.
Реакционную смесь перемешивали в течение 14 суток. После завершенияреакции смола была отфильтрована и промыта 7х10 мл DMF. Контроль заходом реакции, деблокирование Fmoc-группы, а также стадию финальногодеблокирования осуществляли описанным ранее способом. Получено: 375 мг(77 %). После очистки пептида с помощью препаративной ВЭЖХ ипоследующей лиофилизации получено 155 мг (общий выход 32 %), чистота89продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 94.5 %. HRMS (ESI+), m/z:2427.1849 ([М+Н]+), рассчитано 2427.1755.Синтез фрагмента 271-290 белка РВ1H-Leu1-Pro2-Val3-Gly4-Gly5-Asn6-Glu7-Lys8-Lys9-Ala10-Lys11-Leu12-Ala13-Asn14Val15-Val16-Arg17-Lys18-Met19-Met20-OHДанный пептид был синтезирован последовательным наращиваниемпептидной цепи по описанной ранее общей методике (таблица 25).Таблица 25.
Синтез фрагмента 271-290 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocMetOHFmocMetOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocArg(Pbf)OHFmocValOHFmocValOHFmocAsn(Trt)OHFmocAlaOH*H2OFmocLeuOHFmocLys(Boc)OHDICHOBt*H2OFmocAlaOH*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLys(Boc)OHFmocGlu(O-tBu)OHFmocAsn(Trt)OHFmocGlyOHFmocGlyOHFmocValOHFmocProOHFmocLeuOH234567891011121314151617181920НачинаясостаткаМ,г/мольν,ммоль0.7753.10.350.70.840.840.70.70.70.70.70.70.71.051.261.261.051.051.051.051.051.051.051.051.051.05129.2371.5371.5126.2153.1468.5648.8339.4339.4596.7313.3353.4468.5126.2153.1313.3468.5468.5443.5596.7297.4297.4339.4337.4353.4аспарагина-14доm, мг/ V,мкл500401/512130260106/131129328454238238418220247492159/196193329492492466627312312356354371остаткаt, ч21.51.5331524152648121748244862244867;360лейцина-1длядеблокирования Fmoc-группы использовали 3 промывки 20% растворомдиэтиламина в DMF (5, 20 и 10 мин). В случае остатков аспарагина вположениях 6 и 14 наряду с диэтиламином использовали DBU, как было90описано ранее.
Финальное деблокирование и последующее восстановлениепроводили описанным ранее способом. Получено: 344 мг (45 %).очисткицелевогосоединенияспомощьюпрепаративнойПослеВЭЖХипоследующей лиофилизации получено 105 мг (общий выход 14 %), чистотапродукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 97.2 %.
HRMS (ESI+), m/z:2183.2597 ([М+Н]+), 2183.2515 рассчитано.Синтез защищенного фрагмента 381-390 белка РВ1Fmoc-Phe-Asn(Trt)-Glu(O-tBu)-Ser(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)Ile-Glu(O-tBu)-ОНЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 26.Таблица 26.
Синтез защищенного фрагмента 381-390 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocGlu(O-tBu)OHFmocIleOHDICHOBt*H2OFmocLys(Boc)OHFmocLys(Boc)OHFmocArg(Pbf)OHFmocThr(t-Bu)OHFmocSer(t-Bu)OHFmocGlu(O-tBu)OHFmocAsn(Trt)OHFmocPheOH2345678910М,г/мольν, ммоль1.244.960.81.61.921.921.61.61.61.61.61.61.61.6129.2425.5353.4126.2153.1468.5468.5648.8397.4383.4425.5596.7387.4m, мг/ V,мкл800641/820340565242/3002947507501038636613681955620t, ч2222223543После присоединения остатка фенилаланина в положении 1 смола былапромыта дихлорметаном (4х10мл), высушена в вакууме и разделена на 2 равныечасти.
Часть смолы, содержащую 0.4 ммоль пептида, использовали дляотщепления пептида от полимерного носителя с сохранением защитных группсогласно описанной ранее методике. Получено: 690 мг (72 %).Синтез фрагмента 381-390 белка РВ1H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-Lys7-Lys8-Ile9-Glu10- OH91Деблокированиезащитныхгруппфрагмента381-390белкаРВ1проводили описанным ранее способом. Данные по синтезу приведены втаблице 26; для обработки использовали смолу, содержащую 0.4 ммользащищенного пептида.
Получено: 415 мг (83 %).После очистки целевогосоединения с помощью препаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизацииполучено 185 мг (общий выход 37 %), чистота продукта по данныманалитической ВЭЖХ составила 95.2 %. HRMS (ESI+), m/z: 1251.6646 ([М+Н]+),1251.6692 рассчитано.Синтез фрагмента 391-400 белка РВ1H-Lys1-Ile2-Arg3-Pro4-Leu5-Leu6-Val7-Glu8-Gly9-Thr10-OHЦелевое соединение было получено по описанной ранее общей методике,количество реагентов, использованных на каждой стадии, приведено в таблице 27.Таблица 27. Синтез фрагмента 391-400 белка РВ1№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocThr(t-Bu)OHFmocGlyOHDICHOBt*H2OFmocGlu(O-tBu)OHFmocValOHFmocLeuOHFmocLeuOHFmocProOHFmocArg(Pbf)OHFmocIleOHFmocLys(Boc)OH2345678910М,г/мольν, ммоль0.622.480.40.80.960.960.80.80.80.80.80.80.80.8129.2397.4297.4126.2153.1425.5339.4353.4353.4337.4648.8353.4468.5m, мг/V,мкл400321/410159238121/150147340272283283270519283375t, ч222331635185Получено: 353 мг (78 %).
После очистки целевого соединения с помощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 150 мг (общийвыход 33 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 96.5%. HRMS (ESI+), m/z: 1125.6948 ([М+Н]+), 1125.6990 рассчитано.92Синтез фрагмента 381-400 белка РВ1 конвергентным способомH-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6-Lys7-Lys8-Ile9-Glu10-Lys11-Ile12-Arg13-Pro14-Leu15Leu16-Val17-Glu18-Gly19-Thr20-OHРазбивка целевого соединения на фрагменты была проведена по остаткамаргинина и пролина в положениях 6 и 14, были синтезированы и выделенызащищенные фрагменты 1-6 и 7-14 (Таблицы 28 и 29 соответственно).Защищенный фрагмент 15-20 (таблица 30) не подвергали деблокированию сполимерного носителя.Синтез защищенного фрагмента 1-6Fmoc-Phe-Asn(Trt)-Glu(O-tBu)-Ser(t-Bu)-Thr(t-Bu)-Arg(Pbf)-ОНТаблица 28.
Синтез защищенного фрагмента 1-6№123456реагенты2-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocArg(Pbf)OHFmocThr(t-Bu)OHDICHOBt*H2OFmocSer(t-Bu)OHFmocGlu(O-tBu)OHFmocAsn(Trt)OHFmocPheOHМ, г/мольν, ммоль2.128.51.653.33.963.963.33.33.33.3129.2648.8397.4126.2153.1383.4425.5596.7387.4m, г/ V, мл1.371.1/1.41.071.310.5/0.620.611.261.41.971.28t, ч222332После присоединения остатка фенилаланина в положении 1 смола былапромыта дихлорметаном (4х10мл), высушена в вакууме и разделена на 2 части,соответствующие 1.25 и 0.4 ммоль пептида. Часть смолы, содержащую 1.25ммоль пептида, использовали для отщепления пептида от полимерногоносителя с сохранением защитных групп согласно описанной ранее методике.Получено: 1.46 г ( 72 %).Синтез защищенного фрагмента 7-14Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(O-tBu)-Lys(Boc)-Ile-Arg(Pbf)-Pro-ОНТаблица 29.
Синтез защищенного фрагмента 7-14№1реагенты2-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocProOHМ, г/моль129.2337.493ν, ммоль1.325.271m, г/ V, мл0.850.68/0.870.34t, ч22FmocArg(Pbf)OHDICHOBt*H2OFmocIleOHFmocLys(Boc)OHFmocGlu(O-tBu)OHFmocIleOHFmocLys(Boc)OHFmocLys(Boc)OH345678648.8126.2153.1353.4468.5425.5353.4468.5468.522.42.42222221.30.3/0.370.370.710.940.850.710.940.9422333153Получено 1.17г (64 %).Синтез защищенного фрагмента 15-20H-Leu-Leu-Val-Glu(O-tBu)-Gly-Thr(t-Bu)-OHТаблица 30. Синтез защищенного фрагмента 15-20№реагенты12-Cl-Trt-смолаDIPEAFmocThr(t-Bu)OHFmocGlyOHDICHOBt*H2OFmocGlu(O-tBu)OHFmocValOHFmocLeuOHFmocLeuOH23456М, г/мольν, ммоль129.2397.4297.4126.2153.1425.5339.4353.4353.40.562.230.250.50.60.60.50.50.50.5m, мг/ V,мкл360288/37010014976/9492213170177177t, ч223335Защищенный фрагмент 15-20 использовали для дальнейших реакций, неотщепляя от полимерного носителя.Синтез защищенного фрагмента 7-20 конденсацией фрагментов 7-14 и 15-20H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Ile-Glu(O-tBu)-Lys(Boc)-Ile-Arg(Pbf)-Pro-Leu-Leu-ValGlu(O-tBu)-Gly-Thr(t-Bu)-OHК смоле, содержащей 0.25 ммоль фрагмента 15-20 был добавленпредварительно охлажденный раствор 1.11 г (0.61 ммоль) защищенногофрагмента 7-14, 0.166 г (1.22 ммоль) HOAt и 0.19 мл (1.22 ммоль) DIC в 12 млDMF.
Реакционную смесь перемешивали в течение 7 суток. Контроль за ходомреакции осуществляли с помощью теста Кайзера на свободные аминогруппы.После завершения реакции смола была отфильтрована и промыта 7х10 мл DMF,94деблокирование Fmoc-группы осуществляли описанным ранее способом.Полученный фрагмент 7-20, не выделяя, использовали для дальнейшихреакций.Получение целевого соединения - конденсация фрагментов 1-6 и 7-20К смоле, содержащей 0.25 ммоль фрагмента 7-20 был добавленпредварительно охлажденный раствор 1.41 г (0.875 ммоль) защищенногофрагмента 1-6, 0.24 г (1.76 ммоль) HOAt и 0.27 мл (1.76 ммоль) DIC в 12 млDMF.
Реакционную смесь перемешивали в течение 3 суток. Контроль за ходомреакции осуществляли с помощью теста Кайзера на свободные аминогруппы.После завершения реакции смола была отфильтрована и промыта 7х10 мл DMF,финальное деблокирование 5осуществляли описанным ранее способом.Получено: 460 мг (78 %). После очистки целевого соединения с помощьюпрепаративной ВЭЖХ и последующей лиофилизации получено 115 мг (общийвыход 19 %), чистота продукта по данным аналитической ВЭЖХ составила 96.3%. HRMS (ESI+), m/z: 2358.3594 ([М+Н]+), 2358.3503 рассчитано.Синтез фрагмента 381-386 белка РВ1H-Phe1-Asn2-Glu3-Ser4-Thr5-Arg6 -OHФинальное деблокирование пептидил-полимера, содержащего 0.4 ммользащищенного фрагмента 381-386 белка РВ1 (таблица 28) проводили описаннымранее способом. Получено: 265 мг (88 %).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
