Диссертация (1145914)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшегообразования "Санкт-Петербургский государственный университет"На правах рукописиРумянцев Андрей МихайловичГенетический контроль регуляции генов метаболизма метанола удрожжей Pichia pastorisСпециальность 03.02.07 – генетикаДиссертация на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:Д.б.н., проф.

Е.В. СамбукСанкт-Петербург20162Оглавление№стр.1.Введение42.Обзор литературы10Генетический контроль метаболизма азота и углерода у дрожжей2.1. Метаболизм азота у дрожжей и механизмы его регуляции102.2. Регуляция метаболизма углерода у дрожжей S. cerevisiae и P. pastoris192.3. Взаимодействие сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию40азотного и углеродного метаболизма2.4. Метаболизм фосфора у дрожжей S. cerevisiae и механизмы его42регуляции3.Материалы и методы453.1.

Среды и условия культивирования453.2. Плазмиды463.3. Штаммы дрожжей и бактерий483.4. Олигонуклеотиды493.4. Методы524.Результаты и обсуждение604.1Изучение влияния разных типов источников азота и углерода на рост60штамма GS115 P. pastoris4.2Влияние источников азота на экспрессию генов метаболизма метанола634.3Изучение регуляции промоторов генов АОХ1 и АОХ2 в зависимости от65типа источника азота4.4Влияние ингибитора TOR-киназы рапамицина на уровень активности72промотора гена АОХ14.5Получение штаммов P.

pastoris устойчивых к рапамицину764.6Влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора гена AOX18034.7Пролин и глутамат как комплексные источники азота и углерода для85P. pastoris4.8Делеционный анализ промотора гена AOX1874.9Изучение экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P. pastoris954.10 Анализ активности промотора гена АОХ1 P. pastoris с использованием100дрожжей S. сerevisiae4.11 Влияние концентрации фосфата в среде на активность промоторов103генов АОХ1 и АОХ24.12 Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию генов105DAS, FLD, DAK, PpPEX54.13 Анализ влияния делеций в промоторе гена АОХ1 на его регуляцию107фосфатом4.14 Влияние ингибитора циклинзависимых киназ флавопиридола на109уровень активности промотора гена АОХ14.15 Оптимизация условий культивирования штаммов P.

pastoris1115.Заключение1176.Выводы1227.Список используемых сокращений1238.Список цитируемой литературы1249.Приложения14241. ВведениеАктуальность темы исследования. Клетки прокариот и эукариотпостоянно сталкиваются с изменениями условий окружающей среды, в частности,концентрации и доступности основных биогенных элементов. Чувствительность кподобным изменениям и быстрая реакция на них критичны для жизнеспособностиклетки.

Изучение генетических механизмов, лежащих в основе адаптацииорганизмовкусловиямокружающейсреды,являетсяфундаментальнойпроблемой биологии.В живой клетке множество рецепторов обеспечивают постоянный контрольсостава среды. Дальнейшая передача сигнала о наличии питательных веществосуществляется с помощью различных регуляторных путей. Для обеспеченияспецифичности ответа эти пути взаимодействуют между собой на всех этапахпередачи сигнала, формируя единую регуляторную сеть. Подобная интеграцияобеспечивает согласованную регуляцию не просто отдельных генов, а целыхгенных комплексов, контролирующих различныеметаболические пути исостояние клеточных органелл.В клетках дрожжей питательные вещества и их метаболиты служат нетолько ресурсом для биосинтеза и получения энергии, но также сами участвуют врегуляцииметаболическойитранскрипционнойактивности.Изучениедвойственной роли питательных веществ как источников основных биогенныхэлементов и как сигнальных молекул, является необходимым для пониманиямеханизмов регуляции в клетке.Азот является одним из основных биогенных элементов.

Он входит в составнуклеиновых кислот и белков, служащих основой существования живой клетки.Качество и доступность источникаазотаоказывает влияниенавсеметаболические процессы, что ведет к изменению скорости роста и деленияклеток, индуцирует биогенез или, наоборот, деградацию клеточных органелл.Общий ответ клетки на изменение количества и качества источника азота в среденазван азотной регуляцией (Magasanik& Kaiser, 2002).5Исследование механизмов азотной регуляции у дрожжей имеет кактеоретическую,такпрактическуюзначимость.Дрожжи,вчастностиSaccharomyces cerevisiae, зарекомендовали себя как прекрасная модельнаясистема.

Полученные с их помощью фундаментальные знания об организациибиохимических и регуляторных процессов применимы и для клеток другихорганизмов, например человека (Botstein et al., 1997). Так же дрожжи широкоприменяются в биотехнологии, поскольку позволяют сочетать преимуществабактериальных и эукариотических систем экспрессии чужеродныхгенов(Cereghino & Cregg, 2000; Cregg et al., 1993). Они растут на средах относительнопростогосоставапосттрансляционныепродуцентовиприэтоммодификации.рекомбинантныхспособныПрибелков,осуществлятькультивированиинеобычайноважнаосновныедрожжей–возможностьподдержания оптимального баланса между скоростью роста, жизнеспособностьюкультуры и уровнем синтеза целевого белка.

Для этого необходимо созданиецелостной картины, отражающей координированную регуляцию метаболизмаклетки в ответ на сочетание различных факторов среды, таких как тип идоступность источников азота, фосфора и углерода.Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris широко известны в качествесистемыдлягетерологичной экспрессии генов.Онииспользуютсядляпроизводства самых разнообразных белков в больших объемах, начиная отстолбнячного токсина и мышиного эпидермального фактора роста и заканчиваямембраннымибелками,включающимичеловеческиеABCтранспортеры,аквапорины и тетраспанины (Cereghino & Cregg, 2000; Cregg et al., 1993).Изучение механизмов регуляции азотного и углеродного метаболизма ивзаимодействия сигнальных путей у P.

pastoris позволит оптимизировать условиякультивирования этих дрожжей и тем самым увеличить эффективность ихприменения в качестве продуцентов рекомбинантных белков.Генетический контроль метаболизма основных биогенных элементовизучен у дрожжей Saccharomyces cerevisiae (Magasanik & Kaiser, 2002; Самбук,2006). Однако эти дрожжи имеют ряд особенностей, отличающих их от других6родов и видов, даже таких близкородственных как Kluyveromyces. S. cerevisiaeявляются факультативными анаэробами, и способны получать энергию за счётспиртового брожения.

При этом показано, что при высоких концентрацияхглюкозы в среде, S. cerevisiae синтезируют этанол даже в аэробных условиях.Подобное явление, названное Крэбтри эффектом, также сопровождаетсяингибированием активности митохондрий и ферментов цикла трикарбоновыхкислот (Crabtree, 1928).В отличие от S. cerevisiae дрожжи P. pastoris относятся к группе Крэбтринегативных дрожжей (Crabtree negative yeast) и являются облигатными аэробами(Подгорский, 1982).

Дрожжи P. pastoris – метилотрофы и способны использоватьметиловый спирт в качестве единственного источника углерода в среде (Anthony,1982; Троценко, Трогонская, 2012). Промоторы генов метаболизма метанола, вчастности промотор гена алкогольоксидазы I, широко используются дляэкспрессии чужеродных генов (Mattanovich et al., 2012). Регуляция этихпромоторов в зависимости от типа источника углерода в среде изучена спомощью репортерных систем (Tschopp et al., 1987). Выявлен ряд регуляторныхэлементов в составе их последовательностей и связывающихся с нимитранскрипционных факторов (Vogl & Glieder, 2013). Однако, несмотря наогромную практическую значимость, до сих пор не существует цельногопредставленияомолекулярныхмеханизмах,обеспечивающихподобнуюрегуляцию.

Так же остаётся совершенно неизученным, как на экспрессию геновметаболизма метанола влияют качественные и количественные изменения другихкомпонентов среды – типа источника азота или концентрации ортофосфата.В связи с особенностями метаболизма пероксисомы играют огромную рольв функционировании клеток P. pastoris. Эти дрожжи являются одним измодельных объектов для изучения биогенеза и деградации пероксисом (Klei et al.,2006). При этом на сегодняшний день влияние типа источника азота нафункционирование этих клеточных органелл у P.

pastoris практически не изучено.Важнейшую роль в адаптации клетокк условиям среды играютмитохондрии. Механизмы координированной регуляции экспрессии ядерных и7митохондриальныхгеновэукариототличаютсявысокойстепеньюконсервативности. Для грибов, растений и животных ретроградные сигнальныесистемы являются важным регуляторным механизмом, который охватываетбольшое число клеточных процессов, обеспечивающих метаболический гомеостазклеткииорганелл.Изучениемеханизмовмитохондриально-ядернойкоммуникации в клетках дрожжей используют как модель сигналинга оконцентрации кислорода в клетке, формирования оксидативного стресса,старения, апоптоза и развития нейродегенеративных заболеваний человека (Ryanet al., 2007).Генетический контроль ретроградной регуляции был изучен у дрожжей S.cerevisiae,вследствие лабильности их энергетического обмена и способностипереключаться с аэробного дыхания на брожение, а также жизнеспособностимитохондриальных мутантов и клеток, полностью утративших мтДНК (Физикова,2011).

Подобные исследования у P. pastoris осложнены тем, что эти дрожжиявляются облигатными аэробами и неспособны существовать при нарушениифункций митохондрий. Исследование механизмов координированной регуляцииуглеродного и азотного метаболизма позволит предложитьновые подходы кизучению ретроградной регуляции у дрожжей P. pastoris, основанные наприменении сочетаний различных источников азота и углерода, используемыхпри культивировании.Целью данной работы является изучение влияния источников азота иуглерода, а так же концентрации ортофосфата в среде на экспрессию геновметаболизма метанола и биогенеза пероксисом у дрожжей P. pastoris и поискрегуляторных генов, вовлеченных в эти процессы.Длядостиженияцелибылисформулированыследующиезадачиисследования:1.

Определить уровни экспрессии генов метаболизма метанола (AOX1, AOX2,CAT1, DAK, DAS, FLD, FGH) и биогенеза пероксисом (PpPEX1, PpPEX5,PpPEX8 и PpPEX14) в зависимости от типа источника азота и углерода всреде.82. Определить уровни экспрессии генов метаболизма метанола и биогенезапероксисомпри различных концентрациях ортофосфата в средах ссульфатом аммония в качестве источника азота.3. Установить области промотора гена АОХ1, ответственные за регуляцию егоактивности в зависимости от типа источника азота, а так же отконцентрации ортофосфата.4.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации