Автореферат (1145913)

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла

Санкт-Петербургский государственный университетНа правах рукописиРумянцев Андрей МихайловичГенетический контроль регуляции генов метаболизма метанола удрожжей Pichia pastorisСпециальность 03.02.07 – генетикаАвторефератдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукНаучный руководитель:д.б.н., проф. Е.В. СамбукСанкт-Петербург2016Работа выполнена на кафедре генетики и биотехнологии федерального государственногобюджетного образовательного учреждения высшего образования «Санкт-Петербургскийгосударственный университет».Научный руководитель:Елена Викторовна Самбук, доктор биологических наук,профессор кафедры генетики и биотехнологии,Санкт-Петербургский государственный университетОфициальные оппоненты:Тыну Рихович Сойдла, доктор биологических наукведущий научный сотрудник группы генетики митоза,Федеральное государственное бюджетноеучреждение науки «Институт цитологии РАН»,Королёв Владимир Геннадьевич, доктор биологических наук,профессор, заведующий лабораторией генетики эукариот, Федеральноегосударственное бюджетное учреждение «Петербургский институтядерной физики им.

Б.П. Константинова», Национальныйисследовательский центр «Курчатовский институт».Ведущая организация:Федеральное государственное бюджетное научное учреждение«Институт экспериментальной медицины»Защита диссертации состоится 06.10.2016 в 16.00 часов на заседании диссертационногосовета Д 212.232.12 при Санкт-Петербургском государственномуниверситете по адресу: 199034,Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9,Санкт-Петербургский государственный университет, биологический факультет,кафедра генетики и биотехнологии, аудитория 1.С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им.М. ГорькогоСанкт-Петербургского государственного университета и на сайте СПбГУ:https://disser.spbu.ru/files/disser2/disser/yZ97dKrRVF.pdfАвтореферат разослан "___" ______ 2016 г.Ученый секретарьДиссертационного совета Д212.232.12,доктор биологических наукЛюдмила Андреевна МамонАктуальность исследования.

Изучение генетических механизмов, лежащих в основеадаптации клетки к условиям окружающей среды, является фундаментальной проблемойбиологии. В живой клетке множество рецепторов обеспечивают постоянный контроль составасреды. Передача сигнала о наличии питательных веществ осуществляется с помощью различныхрегуляторных путей. Для обеспечения специфичности ответа эти пути взаимодействуют междусобой, формируя единую регуляторную сеть. Подобная интеграция обеспечивает согласованнуюрегуляцию не просто отдельных генов, а целых генных комплексов, контролирующих различныеметаболические пути и состояние органелл клетки.Метилотрофные дрожжи Pichia pastoris способны использовать метиловый спирт вкачестве единственного источника углерода в среде. Промоторы генов метаболизма метанола, вчастности промотор гена алкогольоксидазы I (AOX1), широко применяются для экспрессиичужеродных генов.

Несмотря на огромную практическую значимость, до сих пор не существуетцельного представления о молекулярных механизмах, обеспечивающих подобную регуляцию. Также остаётся совершенно неизученным, как на экспрессию генов метаболизма метанола влияюткачественные и количественные изменения других компонентов среды – источника азота иконцентрации ортофосфата.Начальные этапы утилизации метанола происходят в пероксисомах, которые играютосновную роль в функционировании клеток P. pastoris.

При этом влияние источника азота иконцентрации ортофосфата на функционирование этих клеточных органелл у P. pastorisпрактически не изучено. В последнее время у ряда модельных объектов обнаружена зависимостьсостояния пероксисом от митохондрий. Однако изучение подобного взаимодействия у P.

pastorisосложнено тем, что эти дрожжи являются облигатными аэробами и неспособны существовать принарушении функций митохондрий. Исследование механизмов координированной регуляцииуглеродного и азотного метаболизма позволит предложитьновые подходы к исследованиювзаимодействия органелл у дрожжей P.

pastoris, основанные на применении сочетаний различныхисточников азота и углерода, используемых при культивировании.Целью данной работы является изучение влияния источников азота и углерода, а так жеконцентрации ортофосфата в среде на экспрессию генов метаболизма метанола и биогенезапероксисом у дрожжей P. pastoris и поиск регуляторных генов, вовлеченных в эти процессы. Длядостижения цели были сформулированы следующие задачи исследования:1.

Определить уровень экспрессии генов, кодирующих ферменты катаболизма метанола(AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS, FLD, FGH) и биогенеза пероксисом (PpPEX1, PpPEX5, PpPEX8 иPpPEX14) в зависимости от источника азота и углерода в среде.2. Определить уровень экспрессии генов метаболизма метанола и биогенеза пероксисомпри различных концентрациях ортофосфата в средах с сульфатом аммония в качестве источникаазота.3. Установить области промотора гена АОХ1, ответственные за регуляцию его активности взависимости от источника азота, а так же от концентрации ортофосфата.4. Изучить влияние ингибиторов циклинзависимых и Tor-киназ на экспрессию гена АОХ1.Основные положения, выносимые на защиту.

1. Гены метаболизма метанола и гены,вовлеченные в функционирование и биогенез пероксисом, координированно отвечают наизменение источника азота и концентрации ортофосфата в среде и, таким образом, представляютсобой регулон. 2. В регуляцию экспрессии гена алкогольоксидазы АОХ1 вовлечены TOR-киназы икиназы, ингибируемые флавопиридолом.Научная новизна диссертационной работы. Впервые у дрожжей P. pastoris исследованарегуляция экспрессии генов метаболизма метанола, а так же генов, вовлечённых вфункционирование пероксисом, в ответ на изменение различных факторов среды – источникаазота и концентрации ортофосфата.

Впервые в составе промотора гена AOX1 выявлены участки,вовлечённые в его азотную и фосфатную регуляцию. Продемонстрировано, что ингибитор Тоrкиназного комплекса рапамицин и ингибитор циклин-зависимых киназ флавопиридол, влияют науровень экспрессии гена АОХ1, кодирующего ключевой фермент метаболизма метанола. В ходеработыполученыштаммыP.pastorisиоптимизированыусловиякультивированияметилотрофных дрожжей – продуцентов рекомбинантных белков.Теоретическая и практическая значимость результатов работы.

Полученные в работерезультаты позволили выявить координированную регуляцию генов метаболизма метанола игенов, кодирующих белки пероксисом. Показано, что ключевыми участниками этих сигнальныхпутей, являются Тоr-киназа и циклин-зависимые киназы. Практическая значимость работыопределяется тем, что метилотрофные дрожжи P.

pastoris широко используются в биотехнологиидля синтеза белков различного происхождения, поэтому выявленные механизмы регуляциипозволят поддерживать оптимальный баланс между уровнем экспрессии гетерологичного гена,ростом и жизнеспособностью клеток дрожжей.Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы докладывали иобсуждали на следующих конференциях: на V съезде ВОГиС (Москва, Россия, 2009г.), на 14-йПущинской международной школе-конференции молодых ученых “Биология – наука ХХI века”(Пущино, Россия, 2010 г.), на VI Всероссийской конференции молодых учёных “Стратегиявзаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, Россия, 2012 г.), на III и VIВсероссийских форумах студентов, аспирантов и молодых ученых “Наука и инновации втехнических университетах” (Санкт-Петербург, 2009 и 2012 г.), на V Международной школемолодых ученых по молекулярной генетике “Непостоянство генома” (Звенигород, Россия, 2012г.), на III Международной научной интернет-конференции “Биотехнология.

Взгляд в будущее”(2014 г.), на Международной научно-практической конференции “Актуальные вопросысовременных математических и естественных наук” (Екатеринбург, Россия, 2015 г.), наМеждународном симпозиуме “VII Symposium on Applied Microbiology” (Сан-Паулу, Бразилия,2015 г.). Работа выполнена при поддержке грантов ИАС 3.37.222.2015 и 0.37.235.2015.Публикации. Основные результаты диссертационной работы представлены в виде четырёхстатей, опубликованных в ведущих журналах, рекомендованных ВАК.Структура и объем диссертации. Текст диссертации состоит из следующих разделов:“Введение”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты и обсуждение”,“Заключение”, “Выводы”, “Список цитируемой литературы” и “Приложения”.

Характеристики

Тип файла PDF

PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.

Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.

Список файлов диссертации