Автореферат (1145913), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Диссертацияпредставлена на 141 странице и содержит 46 рисунков и 8 таблиц. В “Списке цитируемойлитературы” представлены 176 источников.Материалы и методыКультивирование дрожжей проводили с использованием модифицированных сред MM, MG(Захаров и др., 1976), Md и YPD (Kaiser et al.,1994) при 25 оС. Все штаммы P.
pastoris,использованные в этой работе, являются производными исходного штамма GS115 (his4) дрожжей P.pastoris (Invitrogen). Качественное и количественное определение активности кислых фосфатаз(КФ) у дрожжей P. pastoris проводили по стандартным методикам (Самсонова и др., 1975; Падкинаи др., 1974). При проведении ПЦР в режиме реального времени в качестве референсных геновиспользовали гены PpACT1 и PpTBP, кодирующие актин и TATA – связывающий белоксоответственно. Ct исследуемого гена в тестируемых пробах оценивали относительно среднегогеометрического Ct этих референсных генов. Результирующие значения для одного из условийпринимали за 100% и значения для других условий сравнивали с данным уровнем. Наличиефлуоресценции белка mRFP определяли с помощью микроскопа Leica TCS SP5 (Leica, Германия) вресурсном центре «Развитие молекулярных и клеточных технологий» СПбГУ. Измерениефлуоресценции проводили на микропланшетном флуориметре “Synergy2” (BioTek, США).Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Excel и GraphPadPrism.
Межгрупповые различия оценивали с помощью U - критерия Манна-Уитни.Результаты и обсуждениеВлияние разных типов источника азота и углерода на рост штамма GS115 P. pastoris.Для оценки влияния разных источников азота на рост дрожжей P. pastoris штамм GS115выращивали в жидких средах различного состава (рис.1). В качестве источников азота быливыбраны сульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевина и пролин. В качестве источниковуглерода использовали глицерин и метанол.Рисунок 1. Рост штаммов P. pastoris в средах с глицерином (MG) или метанолом (MM).
Вкачестве источников азота использовали сульфат аммония (NH4+), глутамин (Gln), глутамат (Glu),мочевину (Urea) и пролин (Pro). А – рост штамма GS115 (his4 AOX1 AOX2) в средах с глицерином(MG) и различными источниками азота. B – рост штамма GS115 (his4 AOX1 AOX2) в средах сметанолом (MM) и различными источниками азота.Показано, что влияние источника азота на скорость роста P. pastoris проявляется только насреде с метанолом в качестве источника углерода.Влияние источников азота на экспрессию генов метаболизма метанола.
Для оценкивлияния источника азота на экспрессию генов метаболизма метанола (MUT-генов) и генов,кодирующих белки пероксисом (PEX-генов), были выделены три группы генов: гены,кодирующие основные ферменты пути утилизации метанола (AOX1, AOX2, CAT1, DAK, DAS, FLD,и FGH), гены, отвечающие за биогенез и деградацию пероксисом (PpPEX5 и PpPEX14), а так жегены, кодирующие белки-регуляторы биогенеза пероксисом - PpPEX8 и PpPEX1.Штамм GS115 выращивали до ранней логарифмической фазы в средах, содержащихметанол, в качестве источника углерода.
В качестве источников азота были выбраны сульфатаммония и пролин, так как они показали наиболее контрастные результаты в экспериментах поросту клеточных культур. Уровень экспрессии исследуемых генов определяли с помощью ПЦР врежиме реального времени (Рис. 2).Рисунок 2. Уровень мРНК генов AOX1 и AOX2, СAT1, DAK, DAS, FLD, FGH, PpPEX5,PpPEX8, PpPEX14 и PpPEX1 в зависимости от типа источника азота в среде. ПЦР в режимереального времени.
Праймеры PAOX1,2F и PAOX1,2FR специфичны к обоим генам AOX1 и AOX2из-за идентичности их последовательностей. Поэтому полученные для генов AOX1 и AOX2результаты отражают суммарный уровень их мРНК. Для всех генов наблюдалось достоверноеразличие уровней мРНК (p-value < 0,01).Показано, что использование пролина в качестве источника азота существенно снижаетуровень экспрессии исследуемых генов по сравнению с сульфатом аммония. Полученныерезультаты позволяют предположить, что данная регуляция осуществляется на уровнетранскрипции.РегуляцияактивностипромоторовгеновАОХ1иАОХ2в зависимости от источника азота. Среди исследуемых генов наибольший интерес представляютгены алкогольоксидаз - AOX1 и AOX2. Это связано с тем, что промотор гена АОХ1 широкоиспользуется в биотехнологии.
Нуклеотидные последовательности генов AOX1 и AOX2практически идентичны. Этот факт в значительной степени затрудняет интерпретацию данныхПЦР в режиме реального времени, так как используемые праймеры будут специфичны к обоимисследуемым генам. Так же показано, что активность гена AOX1 в 10 раз превышает активностьAOX2, что обусловлено разницей в нуклеотидных последовательностях их промоторов. В связи сэтим были получены отдельные репортерные системы для исследования активностей промоторовAOX1 и AOX2.В качестве репортерного гена использовали ген репрессибельной кислой фосфатазы (КФ)PHO5 дрожжей S.
cerevisiae. Были получены штаммы tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4)и tr3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4), характеризующиеся отсутствием активностисобственных КФ и содержащие последовательность гена PHO5 под контролем промоторов геновАОХ1 и АОХ2, соответственно. У данных штаммов активность КФ появляется только на среде сметанолом в качестве источника углерода, в результате индукции промотора АОХ1.Для оценки влияния источника азота на активность промоторов генов АОХ1 и АОХ2штаммы tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4)выращивали в средах с метанолом (ММ) в течение 40 часов, после чего измеряли удельнуюактивность КФ. В качестве источников азота использовали сульфат аммония, глутамин, глутамат,мочевину, пролин и аспарагин (рис. 3).Рисунок 3.
Удельная активность КФ Pho5 (е.а./OD550), секретируемой штаммами tr2-4GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) P. pastoris, всредах с метанолом (ММ) и разными источниками азота. Символом * обозначено достоверноеразличие удельной активности КФ (p-value < 0,01).Показано, что уровень экспрессии репортерного гена под контролем промотора AOX1 вышевсего при использовании хороших источников азота, сульфата аммония и глутамина. Вместе с темоказалось, что при использовании другого богатого источника азота, аспарагина, наблюдаетсязначительное снижение активности КФ.
Подавление активности фермента наблюдали и прииспользовании глутамата, и особенно пролина, бедного источника азота. Интересно, что прииспользовании мочевины, считающейся также бедным источником азота, удельная активность КФвыше, чем при использовании пролина, аспарагина и глутамата.Удельная активность КФ штамма tr3-1-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) составляетлишь около 10% от таковой у штамма tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4). Несмотря насущественную разницу в уровнях активности и самих последовательностях исследуемыхпромоторов, регуляция промотора AOX2 источником азота оказалась сходной с регуляциейпромотора AOX1. Уменьшение удельной активности КФ так же наблюдали при использованиипролина в качестве источника азота.Влияние ингибитора Tor-киназы рапамицина на уровень активности промотора генаАОХ1.
Применение ингибиторов киназ позволяет получить данные об их роли в различныхклеточных процессах. Рапамицин является ингибитором Tor-киназы (Target of Rapamycin) –одного из главных регуляторных белков клетки, в том числе играющего ключевую роль впередаче сигнала об изменении источника азота.Поскольку клетки при добавлении рапамицина не растут, культивирование проводили в двестадии. На первом этапе клетки штамма tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) дляполучения клеточной массы культивировали 48 часов в средах с глицерином (MG) в качествеисточника углерода и пролином или сульфатом аммония в качестве источников азота. Затемклетки центрифугировали, переносили в среды с метанолом (MM) и рапамицином для индукциипромотора AOX1 и культивировали в течение 40 часов.
Как видно (рис. 4), при добавлениирапамицина изменяется регуляция активности промотора АОХ1 пролином.*Рисунок 4. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штамма tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1PHO5 HIS4) при культивировании в среде с метанолом в зависимости от типа источника азота иналичия рапамицина (С=10 нМ). Символом* обозначено достоверное различие удельнойактивности КФ (p-value < 0,01).В среде с рапамицином и пролином уровень удельной активности КФ у штамма tr2-4GS115 достигает уровня, наблюдаемого в аналогичной среде с сульфатом аммония, чтосвидетельствует о репрессии промотора АОХ1 в средах с пролином.У дрожжей P. pastoris регуляция гена АОХ1 источником углерода осуществляется за счётмеханизма его репрессии при наличие глицерина или глюкозы в среде и отдельного механизмаиндукции метанолом. При этом при наличие богатого источника углерода, ген АОХ1 будетрепрессирован даже если в среде присутствует метанол.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
