Автореферат (1145913), страница 4
Текст из файла (страница 4)
Уровень мРНК генов DAK, DAS, FLD и, PpPEX5 в среде с метанолом,сульфатом аммония и разными концентрациями ортофосфата в среде (30 и 1000 мг/л). Для всехгенов наблюдалось достоверное различие уровней мРНК при концентрации ортофосфата 1000мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (для DAS, FLD и PpPEX5 p-value < 0, 02, для DAK p-value < 0,05).Как видно, уровень экспрессии генов DAS1, FLD, PpPEX5 и DAK, как и активностьпромоторов генов АОХ1 и АОХ2, зависит от ортофосфата и повышается при увеличении егоконцентрации в среде.
Следовательно, данные гены, кодирующие ключевые ферментыметаболизма метанола и белки пероксисом, координировано регулируются не только пролином,но и концентрацией ортофосфата в среде.Влияние делеций в промоторе гена АОХ1 на его регуляцию фосфатом. Для поискаэлементов в промоторе гена AOX1, участвующих в его регуляции в зависимости от концентрациифосфата, были использованы созданные ранее штаммы, содержащие репортерный ген РНО5 подконтролем укороченных вариантов промотора AOX1 - trΔSacI-4-GS115 (phox his4::PAOX1ΔSacIPHO5 HIS4) и trΔNsiI-4-GS115 (phox his4::PAOX1ΔNsiI-PHO5 HIS4). Штаммы культивировали вжидкой среде ММ с метанолом и различными концентрациями ортофосфата, после чего измерялиудельную активность КФ (рис.
12).У штамма trΔSacI-4-GS115 с делецией, затрагивающей область промотора от -997 до -771н., не наблюдали изменения активности репортерной КФ в зависимости от концентрацииортофосфата в среде. Следовательно, мы можем говорить о том, что данная область длиной в 266нуклеотидов (от -997 до -771 н.) необходима для регуляции промотора гена АОХ1 ортофосфатом.Рисунок 12. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штаммов trΔSacI-4-GS115 и trΔNsiI-4GS115, несущих делеционные варианты промотора АОХ1 при культивировании в средах сметанолом и различными концентрациями ортофосфата (30 и 1000 мг/л). Символом * обозначенодостоверное различие удельной активности КФ при концентрации ортофосфата 1000 мг/мл посравнению с 30 мг/мл (p-value < 0,01).Влияние ингибитора циклинзависимых киназ флавопиридола на уровень активностипромотора гена АОХ1. Флавопиридол является специфическим ингибитором циклинзависимыхкиназ (Рho85p и Cdc28p у S.
cerevisiae). Киназа Рho85p ключевым регулятором метаболизмаортофосфата в клетках дрожжей S. cerevisiae. Штамм tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4),содержащий последовательность гена красного флуоресцентного белка mRFP под контролемпромотора АОХ1, культивировали в жидких средах МG с глицерином в течение 48 часов. Навтором этапе переносили клетки в среды ММ с метанолом, флавопиридолом и различнымиконцентрациямиортофосфата ипосле 40часов культивированияизмерялиудельнуюфлуоресценцию штамма (рис.13).*Рисунок 13.
Удельная флуоресценция штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) придобавлении флавопиридола и концентрациях фосфата 30 и 1000 мг/л. Символом * обозначенодостоверное различие удельной флуоресценции при концентрации 1000 мг/мл по сравнению с 30мг/мл (p-value < 0,05).Добавление флавопиридола приводит к исчезновению достоверной разницы в удельнойфлуоресценции штамма tr7-GS115 при росте в средах с разными концентрациями ортофосфата 30 и 1000 мг/л. Таким образом, можно предположить, что у P. pastoris существует белок,вовлеченный в регуляцию промотора АОХ1 фосфатом,активность которого ингибируетсядобавлением флавопиридола. В связи с тем, что флавопиридол связывается с циклинзависимымикиназами, возможно, этот белок обладает киназной активностью.ЗаключениеВ ходе работы было показано, что экспрессия генов, кодирующих основные ферменты путиутилизации метанола у P.
pastoris (AOX1, AOX2, СAT1, DAK, DAS, FLD, FGH), а так же генов,кодирующих белки, вовлеченные в биогенез и функционирование пероксисом (PpPEX5, PpPEX8,PpPEX14 и PpPЕХ1), зависит от источника азота в среде. Для всех исследованных геновнаблюдали репрессию в средах с пролином, а для гена AOX1 показано так же снижениеактивности в средах с глутаматом и аспарагином.
Обнаруженная регуляция осуществляется натранскрипционном уровне за счёт изменения активности промоторов MUT- и PEX- генов.Обработка клеток P. pastoris рапамицином приводила к полному исчезновению регуляциипромотора АОХ1 на средах с разными источниками азота. Это позволяет предположить, что Torкиназа играет ключевую роль в данной регуляции. Добавление рапамицина приводило кувеличению активности промотора АОХ1 в средах с пролином до уровней, наблюдаемых в средахс сульфатом аммония.
Можно сделать вывод, что промотор гена АОХ1 регулируется пролином засчёт механизмов репрессии.Анализ активности репортерной КФ у штаммов, содержащих делеции различнойпротяженности в составе промотора гена АОХ1, показал, что его участок от –168 до –98 н.достаточен для обеспечения его регуляции пролином.Помимо регуляции MUT- и PEX- генов пролином было обнаружено, что экспрессия этихгенов так же изменяется в ответ на дефицит ортофосфата в среде. Активность генов АОХ1, АОХ2,DAK, DAS, FLD и PpPEX5 возрастает в средах с высокими концентрациями ортофосфата.Эксперименты с использованием ингибитора флавопиридола позволяют предположить, что вобеспечение данной регуляции у дрожжей P.
pastoris вовлечена циклинзависимая киназа. Делецияобласти промотора гена АОХ1, ограниченной сайтом рестрикции SacI, изменяет его регуляцию взависимости от концентрации ортофосфата.Наши результаты показали, что дрожжи P. pastoris обладают сигнальной системой, котораякоординированнорегулирует экспрессию генов ферментов метаболизма метанола и генов,кодирующих белки пероксисом. Эта система не только реагирует на изменение источника азота всреде, но и обеспечивает оптимальные уровни экспрессии MUT- и PEX- генов в средах сразличными концентрациями ортофосфата. Всё это позволяет предположить, что данные геныформируют регулон.Выводы1. Экспрессия MUT-генов (АОХ1,2, САТ, DAK, DAS1, FLD и FGH), а так же PEX-генов(PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14, и PpPEX1) зависит от типа источника азота в среде.
Репрессия MUTи PEX-генов наблюдается в средах с пролином и глутаматом.2. Уровни экспрессии MUT-генов (AOX1, AOX2, DAS, DAK, FLD), а так же PEX-генов(PpPEX5) зависят от концентрации фосфата в среде и возрастают по мере её увеличения.3. Анализ промотора AOX1 выявил участки, необходимые для его регуляции источникомазота и концентрацией фосфата.
Участок промотора от –168 до –98 н. достаточен для обеспеченияего регуляции в зависимости от типа источника азота. Участок от -997 до -771 н. важен дляустановления его регуляции в зависимости от концентрации фосфата в среде.4. Изучение влияния ингибиторов фосфопротеинкиназ рапамицина и флавопиридола нарегуляцию промотора гена АОХ1 азотом и фосфатом позволяет предположить участие Тоr ициклинзависимых киназ в этих процессах.5. MUT- и PEX-гены, кодирующие ферменты, участвующие в метаболизме метанола, ибелки пероксисом, координировано регулируются в ответ на изменение типа источника азота иконцентрации фосфата и формируют регулон.Список работ, опубликованных по материалам диссертацииСтатьи:1.
Савинов, В.А. Создание тест-системы для изучения генетического контроля регуляциигена алкогольоксидазы 1 дрожжей Pichia pastoris / В.А. Савинов, А.М. Румянцев, Е.В.Самбук, М.В. Падкина // Вестн. СПб. Ун-та. – 2009. – Сер. 3., Вып. 4. – С. 114–119.2. Румянцев, А.М. Влияние источника азота на экспрессию генов, контролирующихпервые этапы утилизации метанола у дрожжей Pichia pastoris / А.М. Румянцев, М.В.Падкина, Е.В. Самбук // Генетика . – 2013 .
– Т. 49. – С. 454–460.3. Rumjantsev, A.M. Effect of Nitrogen Source and Inorganic Phosphate Concentration onMethanol Utilization and PEX Genes Expression in Pichia pastoris / A.M. Rumjantsev,O.V. Bondareva, M.V. Padkina, E.V. Sambuk // TheScientificWorldJournal [electronicresource]. – 2014. – V. 2014. – P. 743615.4. Музаев, Д.М. Новые штаммы дрожжей Pichia pastoris – продуценты гетерологичныхбелков / Д.М. Музаев, А.М. Румянцев, Е.В. Самбук, М.В. Падкина // Экологическаягенетика. – 2015. – Вып. 13. – С.
10–15.Тезисы:5. Румянцев, А.М. Изучение регуляции экспрессии гена АОХ1 в ответ на изменениесостава среды у метилотрофных дрожжей Pichia pastoris / А.М. Румянцев, В.А.Савинов, Е.В. Самбук // V съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров. –2009 г. – С. 44.6. Румянцев А.М. Генетический контроль азотной регуляции генов метаболизмаметанола у дрожжей Pichia pastoris / А.М. Румянцев, Е.В. Самбук // VI Всероссийскаяконференция молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов ирастений с окружающей средой» – 2012 г.
– С. 86.7. Румянцев А.М. Изучение регуляции экспрессии гена AOX1 в ответ на изменениесостава среды у метилотрофных дрожжей Pichia pastoris / А.М. Румянцев, В.А.Савинов, Е.В. Самбук // 14-я международная Пущинская школа-конференциямолодых учёных “Биология - наука XXI века”, – 2010 г. – С. 175.8. Бондарева О.В. Регуляция генов в ответ на изменение состава среды у дрожжей Pichiapastoris / О.В. Бондарева, А.М.
Румянцев, Е.В. Самбук // V Международная школамолодых ученых по молекулярной генетике “Непостоянство генома” – 3-7 декабря2012 г.9. Rumjantsev, A.M. Studying of nitrogen source and phosphate concentration signaltransduction in Pichia pastoris / A.M. Rumjantsev, O.V. Bondareva, M.V. Padkina, K.C.Memetova, E.V. Sambuk // VII Symposium on Applied Microbiology – 29 of May 2015..
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
