Автореферат (1145913), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Чтобы проверить, перекрываются липути регуляции, обеспечивающие репрессию гена АОХ1 пролином и глицерином, выращивалиштамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) 40 часов в средах с глицерином (MG). Затемклетки переносили в среды с глицерином и метанолом, а так же их смесью и добавляли рапамицин(рис.
5).Рисунок 5. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штамма tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1PHO5 HIS4) при культивировании в средах с различными источниками углерода и рапамицином(С=10 нМ). Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (p-value <0,01).Как видно, добавление рапамицина не влияет на репрессию промоторагена АОХ1глицерином.
На среде с рапамицином, содержавшей смесь метанола и глицерина, активности КФпрактически не наблюдали, как и в случае контрольных образцов. Следовательно, механизмрепрессии промотора АОХ1 в средах с пролином, в которые вовлечена Tor-киназа, отличается оттех, что обеспечивают его репрессию источниками углерода, в частности глицерином.Получение мутантов P.
pastoris устойчивых к рапамицину. Мутанты, устойчивые крапамицину, получали у штамма tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) с помощьюультрафиолета. Было отобрано 43 мутанта, которые были условно разделены на двефенотипические группы по скорости роста. В первой группе, включающей 41 мутант из 43,скорость роста штаммов на средах MM с сульфатом аммония и MM с пролином не отличалась отдикого типа. Два мутанта, относящихся ко второй группе характеризовались замедленным ростомна средах с сульфатом аммония.
Для дальнейших исследований было отобрано по одному мутантуиз каждой фенотипической группы - R1-tr2-4-GS115 (RapR phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и R2-tr24-GS115 (RapR phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4). Штаммы R1-tr2-4-GS115 и R2-tr2-4-GS115, а так жеисходный штамм tr2-1-GS115 культивировали 48 часов в средах MG с глицерином и пролином исульфатом аммония в качестве источников азота. Затем культуры центрифугировали и переносиликлетки в среды с метанолом для индукции промотора AOX1.
Культивировали с добавлениемрапамицина в течение 40 часов и оценивали удельную активность КФ (рис. 6).*Рисунок6.Удельная*активность**КФ(OD410/OD550)*штаммовtr2-4-GS115ирапамицинустойчивых мутантов R1-tr2-4-GS115 и R2-tr2-4-GS115 при культивировании в среде сметанолом в зависимости от типа источника азота и наличия рапамицина. Символом * обозначенодостоверное различие удельной активности КФ (p-value < 0,01).Показано, что у мутантов R1-tr2-4-GS115 и R2-tr2-4-GS115 добавление рапамицина в средуне влияет на регуляцию промотора АОХ1, в отличие от контрольного штамма, где регуляцияполностью исчезала. В дальшейшем будет проведён генетический анализ этих мутантов.
Для этихцелей были получены штаммы P. pastoris с разными ауксотрофностями.Влияние делеции в гене PpURE2 на регуляцию промотора гена AOX1. У дрожжей S.cerevisiae транскрипционный фактор Gln3р и его репрессор Ure2р являются мишенями Torкиназногокомплексаприпередачесигналаотипеисточникаазота.Врезультатебиоинформатического анализа для белка Ure2 S. cerevisiae, был выявлен белок P. pastoris свысокой степенью идентичности аминокислотной последовательности.Был получен штамм P. pastoris tr7-4-GS115 (Ppure2∆Shble phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) сделецией в гене PpURE2 и репортерной конструкцией содержащей ген КФ PHO5 под контролемпромотора АОХ1.
Данный штамм выращивали 40 часов в средах с метанолом и сульфатомаммония или пролином. Измеряли удельную активность КФ в культуре дрожжей и сравнивали еёс активностью исходного штамма tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4).Оказалось, что делеция в гене PpURE2 не снимает репрессию промотора AOX1 в среде спролином, следовательно Ure2p у P. pastoris не участвует в регуляции гена АОХ1 пролином.Пролин и глутамат как комплексные источники азота и углерода для P. pastoris.Эксперименты по культивированию штамма GS115 в средах различного состава показали, чтопролин и глутамат влияют на рост культур только в средах с метанолом, который является менеедоступным для усвоения источником углерода, чем глицерин. Причём использование этих двухисточников азота у P.
pastoris приводило к росту культуры до больших клеточных плотностей посравнению с сульфатом аммония, глутамином и мочевиной. Эти результаты позволилипредположить, что в дрожжи P. pastoris способны использовать пролин и глутамат в качествекомплексных источников азота и углерода. Для проверки этого предположения культивировалиштамм GS115 в средах, содержавших только сульфат аммония, глутамин, глутамат, мочевину илипролин (рис. 7).Рисунок 7. Кривые роста штамма GS115 P. pastoris в средах содержащих сульфат аммония,глутамин, глутамат, мочевину или пролин в качестве единственных источников азота и углерода.Как видно, дрожжи P.
pastoris при длительном культивировании способны расти на средахс пролином и глутаматом в качестве комплексных источников азота и углерода. При этом они нерастут в средах, содержавших только сульфат аммония, глутамин или мочевину.У дрожжей S. cerevisiae добавление богатого (предпочтительного) источника азота сульфата аммония в среду приводит к активации азотной катаболитной репрессии и препятствуетсинтезу ферментов, обеспечивающих транспорт и утилизацию бедных источников азота, вчастности пролина. Штамм tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) культивировали в средахс метанолом, содержавших смесь пролина и сульфата аммония, в течение 40 часов и оценивалиудельную активность КФ (рис.
8). Как видно, у P. pastoris несмотря на присутствие сульфатааммония в среде, промотор АОХ1 репрессируется при добавлении пролина. Очевидно, что удрожжей P. pastoris на средах с метанолом в качестве источника углерода, пролинтранспортируется внутрь клетки и метаболизируется, несмотря на наличие в среде богатогоисточника азота – сульфата аммония.Таким образом, регуляция гена АОХ1, а так же остальных MUT- и PEX-генов пролиномотлична от азотной катаболитной репрессии и, возможно, связана с тем, что он используютсядрожжами P. pastoris в качестве комплексного источника азота и углерода, что свидетельствует оразличиях в механизмах азотной регуляции у дрожжей P. pastoris и S. cerevisiae.Рисунок 8.
Удельная активность КФ Pho5 (OD410/OD550) штамма tr2-1-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) P. pastoris. Использовали среду с метанолом и сульфатом аммония, а также среду с метанолом и смесью пролина и сульфата аммония. Наблюдали достоверное различиеудельной активности КФ (p-value < 0,05).Делеционный анализ промотора гена AOX1.
Для выявления регуляторных элементовпромотора гена AOX1, участвующих в его регуляции пролином был проведен делеционныйанализ. Для этого в штамм 4-GS115 (phox his4) P. pastoris вводили конструкции, содержащие генРНО5 под контролем промотора AOX1 с делециями различной протяжённости.Полученные штаммы выращивали в средах MM с метанолом и различными источникамиазота в течение 40 часов, после чего измеряли удельную активность КФ в культуре дрожжей исравнивали её с активностью штамма tr2-4-GS115, несущего нативный промотор (рис.
9).Рисунок 9. Удельная активность КФ Pho5p (OD410/OD550), секретируемой штаммами tr24-GS115, tr∆А-4-GS115, tr∆B-4-GS115, tr∆C-4-GS115 и tr∆D-4-GS115 в средах ММ сметанолом, в зависимости от типа источника азота в среде. Символом* обозначенодостоверное различие удельной активности КФ (p-value < 0,02).Делеции приводили к изменению активности промотора, но при этом сохранялась егорегуляция источником азота в среде. В случае штамма tr∆C-4-GS115 (phox his4::PAOX1ΔC-PHO5HIS4), содержащего делецию в промоторе АОХ1 от −205 до −45 н. удельная активность быланастолько низкой, что не позволяла выявить достоверных различий в средах ММ с сульфатомаммония и пролином. Таким образом, для регуляции промотора АОХ1 пролином необходим идостаточен участок от –168 до –98 н., соответствующий фрагменту С без участков перекрывания ссоседними фрагментами B и D.Влияние неорганического фосфата на активность промоторов генов АОХ1 и АОХ2.Известно, что на экспрессию некоторых генов метаболизма азота и углерода влияет уровеньнеорганического фосфата.
В работе исследовали влияние концентрации ортофосфата наэкспрессию генов метаболизма метанола. Для этого использовали среды с сульфатом аммония иразличными концентрациями фосфата. Штаммы tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr34-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) культивировали в средах с метанолом при концентрацияхортофосфата 30 мг/л и 1000 мг/л, после чего измеряли удельную активность КФ (рис.
10).***Рисунок 10. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штаммовtr2-4-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) в средах с метанолом приконцентрациях ортофосфата 30 и 1000 мг/л. Обозначено достоверное различие удельнойактивности КФ при концентрации ортофосфата 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (* - p-value <0,01, ** - p-value < 0,02).Было показано, что на среде с метанолом и сульфатом аммония в качестве источника азотаактивность промоторов генов АОХ1 и АОХ2 зависит от концентрации ортофосфата и возрастает сеё увеличением.С помощью метода ПЦР-РВ была исследована регуляция других генов P. pastoris,вовлечённых в утилизацию метанола и функционирование пероксисом - DAS, FLD, DAK и PpPEX5в аналогичных условиях (рис. 11).Рисунок 11.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
