Диссертация (1145914), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Алкогольоксидаза функционирует в виде октамера и её сборка изразличных субъединиц, продуктов генов MOD1 и MOD2, позволяет клеткам P.methanolica адаптироваться к условиям среды за счёт различного сродстваобразующихся гетерооктамеров к метанолу. Однако для дрожжей P. pastoris былопоказано, что алкогольоксидаза функционирует только в виде гомооктамеров(Nakagawa et al., 2000).Реакции,катализируемыедвумядругимиформальдегиддегидрогеназой и форматдегидрогеназой, служатферментами,основнымисточником энергии при росте дрожжей на метаноле. Помимо генерации НАД·Hактивность формальдегиддегидрогеназы защищает клетку от токсичного действияформальдегида, который может накапливаться при избытке метанола в среде(Sibirny et al., 1990). Этот фермент так же играет ключевую роль в метаболизмеметиламина, который может служить источником азота для метилотрофных31дрожжей.
При этом на первом этапе внутри пероксисом происходит окислениеметиламина аминооксидазой, что приводит к образованию формальдегида, ионааммония и перекиси водорода (Chung et al., 2010). Далее формальдегид, так жекак и при метаболизме метанола, окисляется до углекислого газа с выделениемэнергии.Формальдегиддегидрогеназа у большинства метилотрофных дрожжейкодируется одним структурным геном (FLD). Этот ген содержит содержит интронпрактически у всех видов, за исключением H. polymorpha. В ряде работ генформальдегиддегидрогеназы используется в качестве селективного маркера,позволяющего проводить отбор трансформантов на средах с метиламином (Chunget al., 2010). Форматдегидрогеназа у P.
pastoris кодируется одним геном (FDH)(Hartner & Glieder, 2006).Другой фермент пути утилизации метанола S–формилглутатионгидролазатак же участвует в нейтрализации токсичных веществ. Штаммы несущие делециив составе гена FGH не растут на средах содержащих метанол (Hartner et al., 2006).У P. pastoris этот фермент работает в цитоплазме, однако у дрожжей C. boidinii онлокализуется в пероксисомах (Klei et al., 2006).Дигидроксиацетонсинтаза у P. pastoris кодируется двумя генами, DAS1 иDAS2.
Их последовательности ориентированы в противоположных направленияхи разделены участком в 2488 нуклеотидов. Как и в случае с генамиалкогольоксидазы (АОХ1 и АОХ2), нуклеотидные последовательности генов DAS1и DAS2 имеют высокую степень гомологии – более 91% (Hartner et al., 2006).Посколькутриключевыхферментаметаболизмаметанола–алкогольоксидаза, каталаза и дигидроксиацетонсинтаза функционируют внутрипероксисом, эти органеллы играют ключевую роль в метаболизме метанола. Уметилотрофных дрожжей пероксисомы имеют наибольший объём среди всехизученных на данный момент организмов.
Так как механизмы биогенеза идеградации пероксисом очень консервативны, метилотрофные дрожжи являютсяосновным модельным объектом для их изучения (Johnson et al., 1999).32При росте на средах с глюкозой в клетках метилотрофных дрожжейприсутствует одна (H. polymorpha) или несколько (C. boidinii) редуцированныхпероксисом, занимающих в клетке очень маленький объём (Leao-Helder et al.,2003). При переносе клеток на среду с метанолом, эти органеллы начинаютусиленно расти, а так же наблюдается появление новых пероксисом. У дрожжейC. boidinii и P.
pastoris (но не у H. polymorpha), пролиферация пероксисоминдуцируется так же олеиновой кислотой, при этом органеллы содержатферменты, участвующие в β-окислениии жирных кислот (Sakai & Subramani,2000).При переносе клеток со среды с метанолом на среды с глюкозой илиэтанолом пероксисомы быстро деградируют (Nazarko et al., 2008). Этот процессназван пексофагией. Выделяют два её механизма – макро- и микропексофагию. Впервом случае пероксисома отделяется от цитоплазмы двумя мембраннымислоями. Сформированная таким образом аутофагосома сливается с вакуолью, гдепроисходит дальнейший процесс деградации. В случае микропексофагии вакуольформирует выпячивания мембраны охватывающие пероксисомы. После ихслияния пероксисома оказывается внутри вакуоли, где и расщепляется (Sakai &Subramani, 2000).У большинства метилотрофных дрожжей направление белков внутрьпероксисом обычно происходит за счёт наличия в них особой сигнальнойпоследовательности PTS1 (peroxisomal targetin sequence).
Эта последовательностьрасполагается в составе С-концевого фрагмента белка и состоит из трёхаминокислот – серина, лизина и лейцина (SKL) (Yurimoto et al., 2011). PTS1распознаётсяспециальнымбелком-переносчикомPex5p,обеспечивающимтранспорт белков внутрь органеллы. У дрожжей P. pastoris и H. рolymorpha всоставе алкогольоксидазы PTS1 не выявлена, а для её направления внутрьпероксисом имеется альтернативная сигнальная последовательность, которая также распознаётся белком Pex5p. Транспорт тиолазы у P. pastoris и аминоксидазы уH.
polymorpha обеспечивается ещё одним сигналом – PTS2 (Yurimoto et al., 2011).Белки Pex8p и Pex14p связаны с мембраной пероксисом и являются ключевыми33компонентами комплекса, обеспечивающего импорт белков внутри органеллы.Эти белки связывают переносчик Pex5p, несущий импортируемый белок.Пероксин Pex1p участвует в рециркуляции белка Pex5p, обеспечивая егоотделение от мембраны пероксисом и поступление обратно в цитоплазму(Veenhuis et al., 1983; Roggenkamp et al., 1975).У P. pastoris и H.
polymorpha гены, кодирующие белки и ферментыпероксисом, обладают высокой степенью гомологии с генами S. cerevisiae.Исключение составляют гены PEX9, PEX11, PEX15 и PEX16, которые необнаружены у метилотрофных дрожжей. Гены PEX18 и PEX21, у S. cerevisiaeотвечают за распознавание и импорт белков с сигналом PTS2, альтернативнымосновному PTS1. У дрожжей P. pastoris и H. polymorpha функции этих геноввыполняет один ген PEX20 (Sacksteder & Gould, 2000).Регуляция экспрессии генов метаболизма метанола у метилотрофныхдрожжей.
Регуляция экспрессии генов метаболизма метанола лучше всегоизучена на примере гена АОХ1, что связано с широким использованием егопромотора в биотехнологии. При выращивании культуры P. pastoris на средесодержащей глюкозу или глицерин этот фермент практически не синтезируется,однако при использовании сред с метанолом доля алкогольоксидазы в клеткахзначительно возрастает и может составлять до 30% массы суммарного белка(Tschopp et al., 1987).
Этанол так же является источником углерода,репрессирующим синтез алкогольоксидазы и других ферментов пути утилизацииметанола в клетке. С физиологической точки зрения это понятно, посколькуокисление этанола алкогольоксидазой привело бы к выработке большихколичеств ацетальдегида, что было бы чрезвычайно опасно для клетки. Однако досих пор остаётся неясным как клетке удаётся на молекулярном уровне различатьстоль сходные по строению субстраты, какими являются этанол и метанол.Регуляция экспрессии гена AOX1 осуществляется на уровне транскрипции ивключает в себя механизм репрессии-дерепрессии в присутствии различныхисточниковуглеродаиотдельныймеханизминдукцииметанолом.Врепрессирующих условиях, при наличии глюкозы или глицерола в среде,34активность гена AOX1 практически отсутствует.
В дерепрессирующих условиях –при углеродном голодании или при выращивании клеток на сорбитоле илиманнитоле в качестве источников углерода - активность гена AOX1 составляетлишь около 2% от наблюдаемой при индукции на среде с метанолом ипрактически в 1000 раз превышает его активность, наблюдаемую прирепрессирующих условиях (Tschopp et al., 1987). Эти факты свидетельствуют отом, что механизмы репрессии-дерепрессии источником углерода и индукцииметанолом, вовлечённые в регуляцию гена AOX1, независимы друг от друга.Подобныйспособрегуляциисходенсрегуляциейразличныхгеновальтернативными источниками углерода у многих микроорганизмов (Schuller,2003).
Примером может служить регуляция генов метаболизма олеата у S.cerevisiae. Хотя дрожжи S. cerevisiae и не растут на метаноле, они способныиндуцировать пролиферацию пероксисом и работу пероксисомальной системы βокисления жирных кислот на среде с олеатом в качестве единственного источникауглерода (Veenhuis & Harder, 1987).У других видов метилотрофных дрожжей регуляция генов, кодирующихструктуру алкогольоксидаз, несколько отличается от регуляции их у P.
pastoris.Гены MOX1 и AOD1, кодирующие структуру алкогольоксидаз у H. polymorpha иC. boidinii, в отличие от генов AOX1 и AOX2 у P. pastoris не репрессируются приналичии глицерина в среде и для их экспрессии индукция метаноломнеобязательна. Метилотрофные дрожжи P.
methanolica обладают обоимимеханизмами регуляции. Ген MOD1 регулируется так же, как и геныалкогольоксидаз у H. polymorpha и C. boidinii – для его экспрессии достаточнолишь отсутствия репрессирующих источников углерода в среде. Ген MOD2,подобно генам AOX1 и AOX2 у P.
pastoris, репрессируется наличием глицерина всреде и для его активации необходима индукция метанолом. Подобные различияочевидно обусловлены разницей в молекулярных механизмах регуляции генов ине связаны с различиями в последовательностях их промоторов. В пользу этогосвидетельствует и тот факт, что в клетках дрожжей H. polymorpha промотор генаAOX1 из P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
