Диссертация (1145914), страница 8
Текст из файла (страница 8)
При наличии только бедныхисточников азота в среде инактивация комплекса TORC1 и высвобождениеTap42p – фосфатазных комплексов приводит к дефосфорилированию Mks1p, еговысвобождению из комплекса с Bmh1p и Bmh2p и связыванию с Rtg2. Белки Rtg1и Rtg3 поступают в ядро и активируют транскрипцию генов, подверженныхретроградной регуляции (RTG – генов).422.4.
Метаболизм фосфора у дрожжей S. cerevisiae и механизмы его регуляцииВ живой клетке ортофосфат является ключевым компонентом нуклеиновыхкислот, молекул АТФ, входит в состав фосфолипидов и фосфопротеидов. Длядрожжей предпочтительным источником фосфора является неорганическийортофосфат. Его перенос из среды осуществляется особыми транспортнымибелками – пермеазами. У дрожжей S.
cerevisiae выявлено несколько пермеаз,обладающих разным сродством к неорганическому фосфату (Bun-ya et al., 1991;Bergwitz et al., 2011; Ghillebert et al., 2011).При полном отсутствии свободного неорганического фосфата в среде дрожжиспособны утилизовать самые разнообразные фосфоорганические вещества. Дляэтого клетки дрожжей обладают целым набором специальных ферментов –фосфатаз, которые осуществляют гидролиз фосфоэфирных связей в составеподобных соединений (Vogel et al., 1990). В зависимости от условий, в которыхработают эти ферменты, их относят к двум разным группам. Кислые фосфатазывыделяются клеткой в периплазматическое пространство, и в связи с этим,приспособлены к работе в кислой среде (pH 3.0-4.0). Щелочные фосфатазыфункционируют внутри клетки в вакуолях и цитоплазме при оптимуме pH 8.0. Удрожжей S. сerevisiae кислые фосфатазы представлены целым семействомизозимов, кодируемых генами РНО3, РНО5, PHO10 и РНО11 (Самбук, Падкина,2013).
Синтез репрессибельных КФ - Pho5p, Pho10p и Pho11p, осуществляетсятолько при дефиците фосфата. Ген РНО5, использованный в данной работе,кодирует основную форму репрессибельной КФ, обеспечивающую большуючасть ей активности (Payne et al., 1995).Синтез репрессибельной КФ Pho5 в норме происходит только при недостаткеортофосфата в культуральной среде (Lau et al., 1998). На рисунке 9 представленасхема регуляции экспрессии гена PHO5 в ответ на изменения концентрацииортофосфата.43Рисунок 9. Регуляция экспрессии гена PHO5 в зависимости от концентрациивнутриклеточного фосфора: (А) при высокой концентрации Pi в клетке комплексциклина Pho80p и циклин-зависимой протеинкиназы Pho85p (Carrol & O’Shea,2002; Toh et al., 1988) фосфорилирует и ингибирует активатор Pho4p скоактиватором Pho2p (Berben et al., 1988), которые (Б) при снижении количестваPi и инактивации циклин-киназного комплекса ингибитором Pho81p запускаюттранскрипцию гена PHO5 и синтез рКФ (Creasy C., 1996, Johnston & Carlson, 1992;Lenburg & O’Shea, 1996).Неорганический фосфат, поступающий в клетку за счёт работы пермеаз ифосфатаз, запасается клеткой в виде полифосфатов – линейных полимеровортофосфорной кислоты (Кулаев, 1975).
Синтез полифосфатов осуществляетсяособымиферментами-полифосфаткиназами,аихрасщепление-44полифосфатазами (Кожин, Тер-Аванесян, 1979; Кожин и др., 1986; Vogel et al.,1989).В настоящей работе исследовали зависимость регуляции генов путиметаболизма метанола и биогенеза пероксисом у P. pastoris при измененииключевых компонентов среды – типа используемого источника углерода и азота,а так же концентрации неорганического фосфата.453. Материалы и методы3.1. Среды и условия культивированияСреда МM на 1 л содержит 800 мл дистиллированной воды, 200 мл 0,1М Naцитратного буфера, рН 4,5, 3,6 г MgSO4•7H2O, 0,1 г CaCl2, 1 г KH2PO4, метанол вконцентрации 1% (как источник углерода), витамины, микроэлементы (400мкл/мл 2500х раствора) (Захаров и др., 1976).
Среда МG в отличие от МMсодержит в качестве источника углерода 1% глицерин. Источники азота (NH4)2SO4, глутамин, глутамат, мочевина, аспарагин и пролин готовили в виде 10храстворов (4,6%) и добавляли отдельно до концентрации 0,46%. Среда МMLотличается от среды МM концентрацией KH2PO4 – 30 мг/л вместо 1 г/л.Минимальная среда Md содержит на 1 л дистиллированной воды 1 г KH2PO4,0,2 г K2HPO4•2H2O, 1 г MgSO4•7H2O, 0,1 г CaCl2, 0,1 г NaCl, 5 г (NH4)2SO4,витамины, микроэлементы (400 мкл/мл 2500х раствора), 20 г глюкозы (Kaiser etal.,1994).
Аминокислоты, необходимые для роста ауксотрофных штаммов,добавляли в концентрации 40 мг/л для лейцина и 20 мг/л для гистидина.Полная среда YPD содержит на 1 л среды: 20 г глюкозы, 20 г пептона, 10 гдрожжевого экстракта (Kaiser et al.,1994).Полные среды ПЕП и ПЕПФО содержат на 1 л среды: 20 г глюкозы, 20 гпептона и 30 мг/л KH2PO4 (в ПЕП) или 1 г/л KH2PO4 (в ПЕПФО) (Захаров и др.,1976).Среда LB содержит на 1л среды 10 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10г NaCl, 10 г агара.
Селекцию устойчивых к ампициллину трансформантовпроводили на среде LB, содержащей ампициллин в концентрации 100 мкг/мл(Sambrook et al., 1989).Среда TYM содержит на 1л среды 20 г триптона, 5 г дрожжевого экстракта,5,8 г NaCl и 1,2 г MgSO4.46Бактериальные культуры выращивали при 37 оС, культуры клеток дрожжейпри 30 оС (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994). Культивирование штаммовдрожжей в жидких средах для последующего определения активности КФпроводили при 25 оС.3.2.
ПлазмидыВ качестве основы для создания большинства плазмид, полученных в даннойработеиспользовалиинтегративныйвекторpPIC9(Invitrogen,США),предназначенный для экспрессии генов в P. pastoris (Рис. 10).Рисунок 10. Схема плазмиды pPIC9. Плазмида содержит ген β-лактамазы,определяющийустойчивостьклетоккампициллину(Amp),фрагмент,необходимый для репликации плазмиды в бактериях (pBR322) маркерный генHIS4, промоторную и терминаторную области гена AOX1 (5’AOX1 и 3’AOX1ТТ),последовательность сигнального пептида α-фактора (S) и полилинкерную областьMCS.47Для клонирования продуктов ПЦР и при создании плазмиды для внесенияделеций в ген PpURE2 использовали бактериальный вектор pJet1.2 (LifeTechnologies, США).
При создании плазмид работы с дрожжами S. cerevisiaeиспользовали мультикопийную плазмиду pRS425 (ATCC, США). Плазмиду pPICZalpha A (Invitrogen, США) использовали в качестве матрицы при амплификациигена устойчивости к зеоцину Sh ble (ZeoR). Плазмиду pCMV6-AC-mR (OriGene,США) использовали в качестве матрицы при амплификации гена mRFP,кодирующего флуоресцентный белок.Плазмиды, созданные в ходе данной работы, представлены в таблице 1.Таблица 1.Плазмиды, созданные в данной работеНазваниеПримечание1pPIC9-AOX1-PHO5Ген КФ РНО5 под контролем промотора АОХ12pPIC9-AOX2-PHO5Ген КФ РНО5 под контролем промотора АОХ23pPIC9-ΔSacI-PHO5Промотор АОХ1 усечён по сайту SacI4pPIC9-ΔPmeI-PHO5Промотор АОХ1 усечён по сайту PmeI5pPIC9-ΔNsiI-PHO5Промотор АОХ1 усечён по сайту NsiI6pPIC9-ΔEspI-PHO5Промотор АОХ1 усечён по сайту EspI7pPIC9-ΔA-PHO5Делеция в промоторе АОХ1 от −296 до −216 н.8pPIC9-ΔB-PHO5Делеция в промоторе АОХ1 от −222 до −188 н.9pPIC9-ΔC-PHO5Делеция в промоторе АОХ1 от −205 до −45 н.10 pPIC9-ΔD-PHO5Делеция в промоторе АОХ1 от −80 до −0 н.11 pPIC9-mRFPГен mRFP под контролем промотора АОХ112 pJet1.2-Ррure2:: ZeoRГен Sh ble фланкированный фрагментами генаРрURE213 pRS425-PAOX1-PHO5Ген КФ РНО5 под контролем промотора АОХ1483.3.
Штаммы дрожжей и бактерийДля конструирования и получения плазмид в препаративных количествах вработе использовали бактериальный штамм E. coli DH-5α. Штамм имеетследующий генотип: F’phi80dlacZ delta(lacZYA-argF)U169 deoR recA1 endA1hsdR17 (rk- m k+) phoA supE44 lambda-thi-1 gyrA96 relA1/F’ proAB+ lacIqdeltaM15Tn10(tetr).ПриизученииактивностипромоторагенаАОХ1P.pastorisсиспользованием дрожжей S.
сerevisiae применяли штамм 1-GRF18 MATα his3-1,12leu2 pho3. Этот штамм был создан в лаборатории биохимической генетики наоснове штамма GRF18, любезно предоставленного доктором А. Хинненом (A.Hinnen, Бельгия).Все штаммы P. pastoris, использованные в этой работе (Табл. 2), являютсяпроизводными исходного штамма GS115 (his4) дрожжей P.
pastoris (Invitrogen).Таблица 2.Штаммы дрожжей P. pastoris, использованные в работеШтаммГенотипGS115his4γ-GS115aox1::PAOX1-chIFNγ HIS44-GS115phox his4tr1-4-GS115phox aox1::PAOX1-PHO5 HIS4tr2-4-GS115phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4tr3-4-GS115phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4tr7-GS115phox PAOX1-mRFP HIS45-GS115aox1:: HIS4tr7-4-GS115phox PAOX1-PHO5 HIS4 ure2::ZeoR49ШтаммГенотипtrΔPmeI-4-GS115phox his4::PAOX1ΔPmeI-PHO5 HIS4trΔEspI-4-GS115phox his4::PAOX1ΔEspI-PHO5 HIS4trΔNsiI-4-GS115phox his4::PAOX1ΔNsiI-PHO5 HIS4trΔSacI-4-GS115phox his4::PAOX1ΔSacI-PHO5 HIS4trΔA-4-GS115phox his4::PAOX1ΔA-PHO5 HIS4trΔB-4-GS115phox his4::PAOX1ΔB-PHO5 HIS4trΔC-4-GS115phox his4::PAOX1ΔC-PHO5 HIS4trΔD-4-GS115phox his4::PAOX1ΔD-PHO5 HIS4R1-tr2-4-GS115phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4 RapRR2-tr2-4-GS115phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4 RapR3.4.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
