Диссертация (1145914), страница 11
Текст из файла (страница 11)
Уровни мРНК генов AOX1 и AOX2, СAT1, DAK, DAS, FLD, FGH,PpPEX5, PpPEX8, PpPEX14 и PpPEX1 в зависимости от типа источника азота всреде. ПЦР в режиме реального времени. Праймеры PAOX1,2F и PAOX1,2FRспецифичныкобоимгенамAOX1иAOX2из-заидентичностиихпоследовательностей. Поэтому полученные для генов AOX1 и AOX2 результатыотражают суммарный уровень их мРНК. Для всех генов наблюдалось достоверноеразличие уровней мРНК (p-value < 0,02).Известно, что уровень мРНК гена не всегда коррелирует с ферментативнойактивностью. В нашей работе определяли уровни активности каталазы,являющейся одним из основных ферментов метаболизма метанола.
Штамм GS115культивировали 40 часов в средах с метанолом и сульфатом аммония илипролином, после чего определяли удельную активность каталазы. Результатыпредставлены на рисунке 13. Показано, что активность фермента гораздо вышепри культивировании дрожжей P. pastoris в средах с сульфатом аммония, чем всредах с пролином. Эти данные согласуются с результатами полученными спомощью ПЦР в режиме реального времени.65Рисунок 13.
Удельная активность каталазы штамма GS115 в зависимости оттипа источника азота в среде (В) в сравнении с уровнями мРНК гена СAT1 (А).Различия значений удельной активности каталазы достоверны (p-value < 0,05).4.3 . Изучение регуляции промоторов генов АОХ1 и АОХ2в зависимости от типа источника азотаСредиисследуемыхгеновнаибольшийинтереспредставляютгены,кодирующие структуру алкогольоксидаз - AOX1 и AOX2. Это в первую очередьсвязано с тем, что промотор гена АОХ1 широко используется в биотехнологии.Нуклеотидные последовательности генов AOX1 и AOX2 практически идентичны.Этот факт в значительной степени затрудняет интерпретацию данных ПЦР врежимереальноговремени,посколькуиспользуемыепраймерыбудутспецифичны к обоим исследуемым генам.
Так же показано, что активность генаAOX1 в 10 раз превышает активность AOX2, что обусловлена разницей внуклеотидных последовательностях их промоторов (Ellis et al., 1985; Koutz et al.,1989).66Последовательности этих генов и аминокислотные последовательностикодируемых ими белков сходны более чем на 90% (Hartner et al., 2006)В связи с этим были созданы отдельные репортерные системы дляисследования активностей промоторов AOX1 и AOX2. Они позволяют изучатьмеханизмы регуляции каждого из них в отдельности и сравнивать их междусобой, что затруднено в случае ПЦР в режиме реального времени.
Кроме того этодаёт возможность проводить поиск регуляторных элементов в составе промоторовэтих генов.В качестве репортерного гена использовали ген репрессибельной кислойфосфатазы (КФ) PHO5 дрожжей S. cerevisiae. Выбор был связан с тем, что влаборатории биохимической генетики СПбГУ были ранее разработаны удобныекачественные и количественные методы измерения ферментативной активностиКФ (Самсонова и др., 1975) и показано соответствие между уровнем экспрессиигена PHO5 и активностью КФ у анализируемых штаммов (Падкина и др., 1974).На первом этапе работы проводили встраивание последовательности генаPHO5 под контроль промотора гена AOX1 в составе вектора pPIC9. Ген PHO5,фланкированный сайтами рестрикции BamHI и EcoRI, синтезировали методомПЦР с праймерами PHO5F и PHO5R по матрице хромосомной ДНК дрожжей S.cerevisiae. Встраивание этого фрагмента ДНК в вектор pPIC9 осуществляли посайтам рестрикции BamHI-EcoRI таким образом, чтобы кодирующая часть генаPHO5 оказалась под контролем промотора АОХ1, при этом последовательностьсигнального пептида фактора типа спаривания MF1, обеспечивающая секрециюгетерологичныхбелков,былазамещенаоригинальнойсигнальнойпоследовательностью КФ.
Общая схема конструирования представлена нарисунке 14.67Рисунок 14. Схема конструирования плазмид pPIC9-AOX1-PHO5 и pPIC9AOX2-PHO5, содержащих кодирующую последовательность гена PHO5 подконтролем промоторов генов AOX1 и AOX2.НаосновеполученнойплазмидыpPIC9-AOX1-PHO5быласозданааналогичная плазмида содержащая ген PHO5 под контролем промотора AOX2.Последовательность промотора гена AOX2, фланкированную сайтами рестрикцииBamHI и AatII, синтезировали методом ПЦР с праймерами PAOX2F и РАОХ2R поматрице хромосомной ДНК дрожжей P.
pastoris. Далее осуществляли встраиваниеданной последовательности в плазмиду pPIC9-AOX1-PHO5 по сайтам рестрикцииAatII-BamHI, что приводило к замещению промотора AOX1 на AOX2. Структуруполученных плазмид проверяли с помощью рестрикционного анализа, а так жеметодами ПЦР и секвенирования (см. Приложения).68НеобходимымэтапомработыбылополучениеP.штаммаpastoris,характеризующегося отсутствием или снижением активности собственных КФ.Мутации индуцировали с помощью УФ. Штамм GS115 выращивали на средеПЕП и измеряли активность КФ у полученных клонов. Среди примерно 1500проанализированных клонов были отобраны 4 мутанта с различной степеньюснижения активности КФ. Один из них, 4-GS115, практически не имел активностисобственной КФ. Он и был выбран в качестве реципиента для трансформации(Табл.
4).Штамм 4-GS115 (his4 phoх) трансформировали линеаризованными по сайтуStuI фрагментами плазмид pPIC9-AOX1-PHO5 и pPIC9-AOX2-PHO5, чтообеспечивало их встраивание в локус his4 и прототрофность по гистидину.Активность КФ у полученных трансформантов анализировали с использованиемсред, содержащих глюкозу или метанол в качестве источников углерода.Показано, что у трансформантов активность КФ появляется только на среде сметанолом в качестве источника углерода, в результате индукции промотораАОХ1 и синтеза репортерной КФ (Табл. 4).
В обоих случаях полученныетрансформантыхарактеризовалисьсходнымифенотипами.Поэтомудлядальнейшей работы были выбраны два - tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5HIS4) и tr3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4).Полученныерезультатысвидетельствуютотом,чтосигнальнаяпоследовательность белка Pho5p дрожжей S. cerevisiae, обеспечивающая егосекрецию в периплазму, эффективно работает и в дрожжах P. pastoris.69Таблица 4.Активность КФ у штаммов P.
pastoris на средах различного состава.Для оценки влияния типа источника азота на активность промотора гена АОХ1штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) выращивали в средах сметанолом (ММ) в течение 40 часов, после чего измеряли удельную активностьКФ. В качестве источников азота использовали сульфат аммония, глутамин,глутамат, мочевину, пролин и аспарагин (Рис. 15).70Рисунок 15. Удельная активность КФ Pho5 (е.а./OD550), секретируемойштаммом tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) P. pastoris, в средах сметанолом (ММ) и разными типами источников азота.
Символом * обозначенодостоверное различие удельной активности КФ (p-value < 0,02).Показано, что уровень экспрессии репортерного гена под контролемпромотора AOX1 выше всего при использовании хороших источников азота,сульфата аммония и глутамина. Вместе с тем оказалось, что при использованиидругого богатого источника азота, аспарагина, наблюдается значительноеснижение активности КФ. Подавление активности фермента наблюдали и прииспользовании глутамата, и особенно пролина, бедного источника азота.Интересно, что при использовании мочевины, считающейся также беднымисточником азота, удельная активность КФ выше, чем при использованиипролина, аспарагина и глутамата.На следующем этапе работы исследовали влияние типа источника азота наактивность промотора гена АОХ2.
Для этого выращивали штамм tr3-4-GS11571(phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) в течение 40 часов в средах с метанолом (ММ) исульфатом аммония или пролином в качестве источников азота. Полученныеданные сравнили с результатами исследования регуляции активности промоторагена АОХ1. Как видно из рисунка 16, удельная активность КФ штамма tr3-1GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) составляла лишь около 10% от таковой уштамма tr2-1-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4). При этом несмотря насущественную разницу в уровнях активности и самих последовательностяхисследуемых промоторов регуляция промотора AOX2 источником азота оказаласьсходной с регуляцией промотора AOX1. Уменьшение удельной активности КФнаблюдали при использовании пролина в качестве источника азота.**Рисунок 16.
Удельная активность КФ Pho5 (е.а./OD550), секретируемойштаммами tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr3-1-GS115 (phoxhis4::PAOX2-PHO5 HIS4) в зависимости от типа источника азота в среде. Указаностандартное отклонение. Символом * обозначено достоверное различие удельнойактивности КФ (p-value < 0,01).724.4 Влияние ингибитора TOR-киназы рапамицина на уровень активностипромотора гена АОХ1Применение ингибиторов киназ позволяет получить данные об их роли вразличных клеточных процессах. У дрожжей S. cerevisiae ключевую роль впередаче сигнала об изменении источника азота в среде играют серинтреониновые протеинкиназы Tor (Target of Rapamycin).
Рапамицин являетсяингибитором Tor-киназы – один из главных регуляторных белков клетки. Этотантибиотик комплексе с белком FKBP связывается с Tor-киназой и полностьюблокирует ее активность (Loewith & Hall, 2011).Для определения активной концентрации рапамицина клетки штамма GS115высевали разведениями (от 106 до 103 кл/мл) на среду с разным количествомантибиотика (от 10нМ до 200 нМ). Как видно, ингибирование роста наблюдаетсяуже при концентрации рапамицина 10 нМ (рис.
17). Именно эта концентрациябыла использована для определения влияния рапамицина на активностьпромотора гена AOX1.Рисунок 17. Рост штамма GS115 при добавлении рапамицина в среду (10нМ) в сравнении с контролем (без антибиотика). Треугольником схематичноизображено уменьшение концентрации клеток от 106 кл/мл до 103 кл/мл.Поскольку клетки при добавлении рапамицина не растут, культивированиепроводили в две стадии. Сначала клетки штамма tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1PHO5 HIS4) для получения клеточной массы культивировали 48 часов в средах с73глицерином (MG) в качестве источника углерода и пролином или сульфатомаммония в качестве источников азота. Затем культуры центрифугировали ипереносили клетки в среды с метанолом (MM) для индукции промотора AOX1.Культивирование длилось 40 часов с добавлением рапамицина во все пробы, заисключением контрольной.
Такой способ культивирования широко используетсяв биотехнологии при синтезе токсичных для клетки белков (Kim et al., 2013).*Рисунок 18. Удельная активность КФ (OD410/OD550), секретируемой штаммомtr2-4-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) при культивировании в среде сметанолом в зависимости от типа источника азота и наличия рапамицина.Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (p-value< 0,02).Как видно (рис. 18), при добавлении рапамицина изменяется регуляцияактивности промотора АОХ1 пролином.
Всреде с рапамицином и пролиномуровень удельной активности КФ у штамма tr2-4-GS115 соответствовалнаблюдаемому в аналогичной среде с сульфатом аммония. Полученныерезультаты свидетельствуют о том, что наблюдаемая регуляция промотора АОХ1осуществляется за счёт его репрессии в средах с пролином.74У дрожжей P. pastoris регуляция гена АОХ1 источником углерода в средеосуществляется за счёт механизма репрессии промотора АОХ1 при наличиеглицерина или глюкозы в среде и отдельного механизма его индукции метанолом.При этом при наличие богатого источника углерода, ген АОХ1 будетрепрессирован даже если в среде присутствует метанол.На следующем этапе проверяли, перекрываются ли механизмы, регуляции,обеспечивающие репрессию гена АОХ1 пролином и механизмы репрессииглицерином и глюкозой.Для этого выращивали штамм tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) 48часов в средах с глицерином (MG).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
