Диссертация (1145914), страница 14
Текст из файла (страница 14)
В ходе первого раунда ПЦР синтезировалифрагментыпромотора,фланкирующиевносимыеделеции.Использовалифланкирующие праймеры (PAOXFlaF и PAOXFlaR) и праймеры для внесенияделеций: delAF и delAR для участка А, delВF и delВR для участка В, delСF иdelСR для участка С, delDR для участка D. Полученные последовательностисшивали в ходе второго раунда ПЦР за счёт того, что в состав праймеров длявнесения делеций были введены перекрывающиеся участки. Полученныеварианты промотора АОХ1 с делециями встраивали в плазмиду pPIC9-AOX1PHO5 с использованием сайтов рестрикции AatII-BamHI. Наличие требуемыхделеций проверяли с помощью методов ПЦР и секвенирования.
Общая схемаконструирования плазмид представлена на рисунке 30.93Рисунок30.Схемаконструированияплазмид,содержащихделециифрагментов A, B, C и D внутри промоторной области гена AOX1.Осуществляли трансформацию штамма 4-GS115 (his4 phox) полученныхплазмид фрагментами линеаризованными по сайту StuI, что обеспечиваловстраивание фрагментов в локус his4. У отобранных трансформантов с помощьюПЦР было подтверждено наличие требуемых делеций.
Активность КФ утрансформантов анализировали с использованием сред, содержащих глюкозу илиметанол в качестве источника углерода. У всех полученных трансформантов94активность КФ проявлялась только после индукции промотора АОХ1 метанолом.Для дальнейшей работы было выбрано по одному клону: trА-4-GS115, trB-4GS115, trC-4-GS115 и trD-4-GS115. Штамм tr2-4-GS115, несущий конструкциюс нативным промотором, был использован в качестве контроля.Полученные штаммы выращивали в течение 40 часов в средах MM сметанолом и сульфатом аммония или пролином в качестве источников азота,после чего измеряли удельную активность КФ в культуре дрожжей (Рис.
31).****Рисунок 31. Удельная активность КФ Pho5p (OD410/OD550), секретируемойштаммами tr2-4-GS115, trА-4-GS115, trB-4-GS115, trC-4-GS115 и trD-4GS115 в средах ММ с метанолом, в зависимости от типа источника азота в среде.Символом * обозначено достоверное различие удельной активности КФ (p-value< 0,02).Показано, что делеция участка D не влияла на активность промотора АОХ1, тогдакак удаление других фрагментов снижало удельную активность репортерной КФ.При этом регуляция промотора АОХ1 в зависимости от типа используемогоисточника азота сохранялась для вариантов с делециями фрагментов А, В и D.Удельная активность КФ у штаммов trА-4-GS115, trB-4-GS115 и trD-4-GS115,как и у контрольного штамма tr2-4-GS115, была заметно выше в средах с95сульфатом аммония. В случае штамма trC-4-GS115 удельная активность КФбыла необычайно низкой и составляла менее 3% от уровня демонстрируемогоконтрольным штаммом tr2-4-GS115.
При столь низкой активности промотора,несущего делецию фрагмента С, не было выявлено достоверных различийудельной активности КФ при культивировании штамма trC-4-GS115 в средахММ с сульфатом аммония и пролином. Таким образом было показано, что длярегуляции промотора АОХ1 пролином необходим и достаточен участок от –168 до–98 н., соответствующий фрагменту С без участков перекрывания с фрагментамиB и D.4.9. Изучение экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P. pastorisСовременные исследования показали, что при кардинальных измененияхусловий среды клетки дрожжей в культуре могут неоднородно реагировать наподобное воздействие.
Даже если речь идет о генетически однородныхпопуляциях клеток, при изменении источника биогенных элементов часть клетокбудет продолжать использовать предыдущий источник, несмотря на то, что онпредставлен в следовых количествах. Подобное явление позволяет популяциямклеток дрожжей быстрее реагировать на изменения состава среды и эффективнееконкурировать с другими микроорганизмами. В частности при возврате кпредыдущим условиям такая неоднородная популяция, за счёт части клеток уженацеленных на использование исходного источника биогенных элементов,быстрее вернется к усвоению исходных питательных веществ.Для того, чтобы изучить динамику экспрессии гена АОХ1 в популяции клетокP.
pastoris был создан штамм, несущий репортерную конструкцию, позволяющуюоценить уровень активности промотора АОХ1 в отдельной клетке. При этом вкачестве репортерного гена был использован ген mRFP, кодирующий структурукрасного флуоресцентного белка.КонструированиеплазмидыpPIC9-АОХ1-mRFPпроводилианалогичноплазмиде pPIC9-АОХ1-РНО5. Последовательность гена mRFP, кодирующая96красный флуоресцентный белок, была амплифицирована с помощью ПЦР сплазмидой pCMV6-AC-mR в качестве матрицы. В состав праймеров введены сайтырестрикции BamHI и EcoRI, которые были использованы для встраивания данногофрагмента под контроль промотора гена АОХ1 в составе плазмиды pPIC9.Линеаризованным с помощью рестриктазы StuI фрагментом плазмиды pPIC9АОХ1-mRFP трансформировали исходный штамм GS115.
Трансформантовотбирали по восстановлению прототрофности по гистидину. Полученные штаммыпроверяли методами ПЦР, секвенирования и с помощью флюоресцентноймикроскопии(Рис.32).Увсехполученныхтрансформантовсинтезфлюоресцентного белка наблюдался только в результате индукции промотораАОХ1 в средах с метанолом. Один из них – tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4)был использован для дальнейшей работы.Рисунок 32. Флуоресценция штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4)после 10 часов роста в жидких средах с различными источниками углерода иазота.Далее клетки штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) выращивали втечение 40 часов в средах с метанолом (ММ) и сульфатом аммония или пролином.97Флуоресценцию детектировали с помощью спектрофлюориметра “Synergy2” влаборатории регуляции липидного обмена Института ЭкспериментальнойМедицины (ИЭМ РАН).
Оценивали удельную флуоресценцию штамма tr7-GS115(Рис. 33). Результаты согласуются с данными, полученные с помощью системы срепортерным геном PHO5 и методом ПЦР в режиме реального времени. Приросте культур штамма tr7-GS115 в средах с метанолом уровень экспрессиирепортерного гена под контролем промотора AOX1 выше при использованиисульфата аммония в качестве источника азота, чем при использовании пролина.**Рисунок 33. Сравнение значений удельной флуоресценции штамма (ед.фл./OD550) tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4) (А) и удельной активности КФ(е.а./OD550) у штамма tr2-4-GS115 (phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) (В) при росте всредах ММ с метанолом и сульфатом аммония или пролином в качествеисточников азота.
Символомактивности КФ (p-value < 0,05).* обозначено достоверное различие удельной98Чтобы изучить динамику экспрессии гена АОХ1 в популяции клеток P.pastorisкультурувыращиваливштаммажидкойштаммасредеtr7-GS115YPDдо(his4::PAOX1-mRFPстационарнойфазы.HIS4)Клеткицентрифугировали и переносили в среду для голодания (М), в которойотсутствовали источники углерода и азота. После 24 часов культивированияклетки переносили в среды ММ с метанолом и пролином или сульфатом аммония.Каждые 10 часов проводили измерение флуоресценции клеток с помощьюпроточного цитофлуориметра.
На рисунке 34 представлены гистограммы,отражающие долю флуоресцентных клеток после 10 часов индукции метанолом.Рисунок 34. Флуоресценция клеток штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFPHIS4) при росте в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония или пролином(0,46%) в качестве источников азота. На среде с пролином заметно разделениеклеток в культуре на флуоресцирующие и несинтезирующие белок mRFP.99При росте штамма tr7-GS115 в среде с метанолом и сульфатом аммония после10 часов индукции практически все клетки синтезируют флуоресцентный белок.А при его культивировании в среде с метанолом и пролином активация синтезарепортерного белка наблюдается лишь у части клеток.
При этом клетки вкультуре можно строго разделить на две группы – у части клеток произошлаиндукция промотора АОХ1 и флуоресцентный белок накапливается в цитоплазме,у другой части клеток промотор АОХ1 остаётся неактивным.На рисунке 35 показано как меняется доля флуоресцирующих клеток штаммаtr7-GS115 при росте в средах с метанолом и сульфатом аммония или пролином.Рисунок 35. Доля флуоресцирующих клеток штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1mRFP HIS4) при росте в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония илипролином в качестве источников азота.Таким образом, в среде, содержащей пролин, культура штамма tr7-GS115оказалась неоднородна в отношении активности промотора АОХ1.
Несмотря на100то, что часть клеток начинает использовать метанол довольно быстро, в целом всеклетки культуры переключаются на его утилизации только после 20 часовкультивирования. На среде с сульфатом аммония индукция промотора АОХ1происходит гораздо быстрее.СозданиештаммаP.pastorisсинтезирующеговнутриклеточныйфлуоресцентный белок, который накапливается в цитоплазме, необходимо так жеи для решения практических задач.
В биотехнологии с помощью дрожжей P.pastoris синтезируют как внутриклеточные, так и секреторные белки (Barr et al.,1992, Celik & Calik, 2012). Полученный нами штамм tr2-4-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4), несущий ген репортерной КФ PHO5 под контролемпромотора АОХ1, проявил себя как необычайно удобная система для оптимизацииусловий синтеза рекомбинантных белков. Однако, поскольку у данного штаммапри индукции метанолом КФ секретируется в среду, полученные с его помощьюрезультаты будут более применимы для подбора условий культивированияштаммов - продуцентов секреторных белков. Для оптимизации синтезацитоплазматических более подходящей окажется именно система на основевнутриклеточного флуоресцентного белка.4.10. Анализ активности промотора гена АОХ1 P. pastoris сиспользованием дрожжей S.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
