Диссертация (1145914), страница 15
Текст из файла (страница 15)
сerevisiaeОдним из подходов к изучению механизмов регуляции в клетке являетсяиспользованиемодельныхобъектов.ДрожжиS.сerevisiaeявляютсяблизкородственными с дрожжами P. pastoris, но при этом изучены в большейстепени (Hahn & Young, 2011). Поэтому в данной работе мы использовалидрожжи S. сerevisiae в качестве гетерологичного хозяина для изучениямеханизмов регуляции гена АОХ1. Для этого на основе вектора pRS425 быласоздана плазмида, содержащая репортерный ген PHO5 КФ дрожжей S.
сerevisiaeпод контролем промотора гена AOX1 P. pastoris (Рис. 36). Последовательность101PAOX1-PHO5 была получена в ходе ПЦР с праймерами FAOX1 и RPHO5 сплазмидой pPIC9-AOX1-PHO5 в качестве матрицы. Её встраивание в векторpRS425 проводили по двум сайтам клонирования - PstI и NotI.LEU2PstINotIpRS4256849 п.о.2 micronPMB1AmpNotIPstIPA OX1 -PHO5PstI2400 п.о.NotILEU2PstINotINotIPstIpRS425PA OX1 -PHO52400 п.о.2 micronPMB1AmpPstISacIPAOX1LEU2BamHIPHO5pRS425-PAOX1 -PHO59100 п.о.NotISacI2 micronPMB1AmpРисунок 36. Основные этапы конструирования плазмиды pRS425-PAOX1PHO5, содержащей кодирующую последовательность гена PHO5 под контролемпромотора гена AOX1.ПлазмидойpRS425-PAOX1-PHO5трансформировалиштамм1-GRF18дрожжей S.
cerevisiae. В связи с тем, что плазмида pRS425-PAOX1-PHO5содержит маркерный ген LEU2, трансформанты отбирали на селективной средепо восстановлению способности синтезировать лейцин. Активность КФ у102трансформантов анализировали с использованием сред, содержащих глюкозу илиглицерин в качестве источника углерода.Показано, что у полученных трансформантов активность КФ появляетсятолько на среде с глицерином в качестве источника углерода в результатеиндукции промотора АОХ1 (Табл. 8). Это свидетельствует о том, что в отличие отP.pastoris у S. cerevisiae глицерин не репрессирует промотор гена АОХ1.Интересно, что глицерин не репрессирует гены метаболизма метанола унекоторых других метилотрофных дрожжей, в частности H. polymorpha (Hartner& Glieder, 2006).Таблица 8.Активность КФ на средах различного состава у штамма 1-GRF18 итрансформанта 1-GRF18, несущего генетическую конструкцию pRS425-PAOX1PHO5.Наличие активности КФ у штаммовСреда1-GRF181-GRF18/pRS425PAOX1-PHO5Md сглюкозойMd сглицериномБыл исследован характер экспрессии репортерного гена PHO5 под контролемпромотора АОХ1 у полученных трансформантов S.
cerevisiae в средах сглицерином и разными источниками азота (Рис. 37).103Рисунок 37. Удельная активность КФ Pho5p (OD410/OD550), секретируемойштаммом 1-GRF18 S. cerevisiae, несущим плазмиду pRS425-PAOX1-PHO5, при еговыращивании в средах MG с глицерином и разными источниками азота.Достоверных различий удельной активность КФ не наблюдали.Не было выявлено статистически значимых различий в активности и КФ и,следовательно,врегуляциипромоторагенаAOX1приегоработевгетерологичном хозяине - дрожжах S. сerevisiae.
Это свидетельствует о том, чторегуляцияактивностигенаAOX1источникомазотавсредеявляетсяотличительной чертой дрожжей P. pastoris и её наличие возможно связано именнос особенностями метаболизма метилотрофных дрожжей.4.11. Влияние концентрации фосфата в среде на активность промоторовгенов АОХ1 и АОХ2Результаты предыдущих исследований показали, что сульфат аммония иглутамин являются лучшими источниками азота для обеспечения экспрессиигенов метаболизма метанола и, в частности, АОХ1.
Известно, что на экспрессиюнекоторых генов метаболизма азота и углерода влияет уровень неорганического104фосфата. Поэтому мы иследовали влияние концентрации ортофосфата наэкспрессию генов метаболизма метанола. Для этогоиспользовали среды ссульфатом аммония и различными концентрациями фосфата.ОценилиналичиерегуляциипромотораАОХ1взависимостиотконцентрации ортофосфата в среде. Для этого штамм tr2-1-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) выращивали в средах с метанолом при различныхконцентрациях ортофосфата в среде в диапазоне от 10 мг/л до 1,5 г/л.Приувеличении концентрации фосфата удельная активность КФ возрастает примернов 1,3 раза при сравнении крайних значений, что свидетельствует о наличиирегуляции фосфатом промотора АОХ1 (Рис. 38).
Для дальнейших исследованийбыли выбраны две концентрации фосфата, при которых удельная активность КФстатистически достоверно различалась — 30 мг/л и 1000 мг/л.Далее сравнили активности промоторов генов АОХ1 и АОХ2 при различныхконцентрациях ортофосфата в среде. Штаммы tr2-1-GS115 (phox his4::PAOX1PHO5 HIS4) и tr3-1-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) культивировали 40часов при концентрациях ортофосфата 30 мг/л и 1000 мг/л, после чего измерялиудельную активность КФ. В качестве источника азота использовали сульфатаммония.Как видно из рисунка 40, активность КФ штаммов tr2-1-GS115 (phoxhis4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr3-1-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) приувеличении концентрации ортофосфата увеличивается примерно в два раза.105***Рисунок 38.
Удельная активность КФ (OD410/OD550) штаммов tr2-4-GS115(phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) и tr3-4-GS115 (phox his4::PAOX2-PHO5 HIS4) всредах с метанолом при концентрациях ортофосфата 30 и 1000 мг/л. Обозначенодостоверное различие удельной активности КФ при концентрации ортофосфата1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (* - p-value < 0,01, ** - p-value < 0,02).Полученные данные свидетельствуют о том, что на среде с метанолом исульфатом аммония в качестве источника азота активность промоторов геновАОХ1 и АОХ2 зависит и от концентрации ортофосфата.
Уровни экспрессии геновАОХ1 и АОХ2 возрастают с увеличением концентрации ортофосфата в среде.4.12. Изучение влияния концентрации ортофосфата на экспрессию геновDAS, FLD, DAK, PpPEX5Ранее было показано, что гены, кодирующие ферменты метаболизмаметанола - AOX1, AOX2, СAT1, DAK, DAS, FLD, FGH, а так же гены, кодирующиебелки, вовлеченные в биогенез и функционирование пероксисом PpPEX5,106PpPEX8, PpPEX14 и PpPЕХ1, координированно реагируют на изменение типаисточника азота в среде. Активность всех этих генов подавляется в присутствиипролина, что говорит о сходстве механизмов, обеспечивающих их регуляцию.
Дляизучения влияния концентрации ортофосфата из этой группы генов быливыбраны DAS, FLD, DAK и PpPEX5 и их активность была исследована с помощьюметода ПЦР в режиме реального времени. В качестве референсных геновиспользовали гены АСТ1 и ТВР1, кодирующие актин и белок, связывающийся сТАТА – последовательностью, соответственно. Исходный штамм GS115культивировали в средах ММ с метанолом и сульфатом аммония в качествеисточника азота. Использовали среды с разными концентрациями ортофосфата 30 и 1000 мг/л.
Результаты оценки уровней мРНК исследуемых геновпредставлены на рисунке 39.****Рисунок 39. Уровни мРНК генов DAK, DAS, FLD и, PpPEX5 в среде сметанолом, сульфатом аммония и разными концентрациями ортофосфата в среде(30 и 1000 мг/л). Символом * обозначено достоверное различие уровней мРНК107при концентрации ортофосфата 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (для DAS,FLD и PpPEX5 p-value < 0,01, для DAK p-value < 0,05).Как видно из рисунка 41 уровень экспрессии генов DAS, FLD, PpPEX5 и DAKповышается при увеличении концентрации фосфата в среде. Экспрессия гена DASвозросла в 1,7 раз, гена FLD – в 2 раза, генов DAK и PpPEX5 – 1,5, 1,4 и 1,3 раза,соответственно.На основании полученных данных можно заключить, что уровень экспрессиигенов DAS1, FLD, PpPEX5 и DAK, как и активность промоторов генов АОХ1 иАОХ2 зависит от концентрации фосфата.
При этом уровень экспрессии этих геновпрямопропорционален концентрации фосфата в среде. Данные гены, кодирующиеключевые ферменты метаболизма метанола и белки пероксисом, координированорегулируются не только источником азота – пролином, но и конценрациейортофосфата в среде.4.13. Анализ влияния делеций в промоторе гена АОХ1 на его регуляциюфосфатомДляпоискарегуляторныхэлементоввсоставепоследовательностипромотора гена AOX1, участвующих в его регуляции в зависимости отконцентрациифосфатабылииспользованысозданныеранеештаммы,содержащие репортерный ген РНО5 под контролем усечённых вариантовпромотора AOX1. Были выбраны следующие штаммы: trΔSacI-4-GS115, которыйсодержит делецию 226 нуклеотидов и штамм trΔNsiI-4-GS115 (делеция 735 н.).Для оценки влияния делеций промоторной области гена АОХ1 на регуляциюортофосфатом,штаммы культивировали 40 часов в жидкой среде ММ сметанолом и различными концентрациями ортофосфата, после чего измерялиудельную активность КФ.
В качестве контроля использовали штамм tr2-4-GS115(phox his4::PAOX1-PHO5 HIS4) с полным промотором. Результаты представленына рисунке 40.108*Рисунок 40. Удельная активность КФ (OD410/OD550) штаммов, несущихделеционные варианты промотора АОХ1 при культивировании в средах сметанолом и различными концентрациями ортофосфата (30 и 1000 мг/л).Символом* обозначено достоверное различие удельной активности КФ приконцентрации ортофосфата 1000 мг/мл по сравнению с 30 мг/мл (p-value < 0,01).У штамма trΔSacI-4-GS115 с делецией, затрагивающей область -997-771,удельная активность КФ возрастает примерно в 3 раза при концентрации фосфата30 мг/л и почти в 1,5 раза при концентрации 1000 мг/л по сравнению с контролем.Так же меняется регуляция: при полном промоторе экспрессия КФ выше приконцентрации фосфата 1000 мг/л.
Следовательно, мы можем говорить о том, чтоданная область длиной в 266 (-997-771) нуклеотидов необходима для регуляциифосфатом активности промотора гена АОХ1.При удалении более протяженных участков промотора удельная активностьрепортерной КФ заметно снижается по сравнению с контролем. О наличии109достоверных отличий в экспрессии промотора гена при таких уровнях активностиговорить затруднительно.4.14.
Влияние ингибитора циклинзависимых киназ флавопиридола науровень активности промотора гена АОХ1Флавопиридол является специфическим блокатором циклинзависимых киназ,вчастностикиназыРho85p,котораяявляетсяключевымрегуляторомметаболизма ортофосфата в клетках дрожжей S. cerevisiae (Carrol et al., 2001,Senderowicz, 1999).Для определения активной концентрации флавопиридола клетки штаммаGS115 высевали разведениями (от 106 до 103 кл/мл) на среду с разнымколичеством антибиотика.Как видно из рисунка 41, ингибирование ростанаблюдается только начиная с концентрации флавопиридола в 100 мкМ.Концентрация200мкМбылаиспользованадляопределениявлиянияфлавопиридола на активность промотора гена AOX1.Рисунок41.РостштаммаGS115приразличныхконцентрацияхфлавопиридола в среде.
Треугольником схематично изображено уменьшениеконцентрации клеток от 106 кл/мл до 103 кл/мл.110Измерение активности промотора АОХ1 при добавлении флавопридолапроводили у штамма tr7-GS115 (his4::PAOX1-mRFP HIS4). Так же, как и придобавлении рапамицина, культивирование производилось в два этапа. Результатыпоказали (рис. 42), что при добавлении флавопиридола достоверная разница вудельной флуоресценции исчезает.*Рисунок 42. Удельная флуоресценция штамма GS115-RFP при добавлениифлавопиридола и концентрациях фосфата 30 и 1000 мг/л. Символом * обозначенодостоверное различие удельной активности КФ при концентрации 1000 мг/мл посравнению с 30 мг/мл (p-value < 0.05). При добавлении флавопиридоластатистически достоверное различие исчезало (p-value = 0.2).В контрольной пробе активность промотора гена АОХ1 достоверноразличалась (p-value < 0.05) при концентрациях фосфата 30 мг/л и 1000 мг/л. Придобавлении флавопиридола статистически достоверное различие исчезало (pvalue = 0.2).
Стоит также отметить, что, в отличие от воздействия рапамицина,активность в опытной пробе сопоставима по уровню с контрольной.Таким образом, можно предположить, что у P. pastoris существует белок,вовлеченный в регуляцию промотора АОХ1 фосфатом,активность которого111ингибируется добавлением флавопиридола. Т.к. флавопиридол связывается сциклинзависимыми киназами (Sedlacec et al., 2001), возможно, этот белокобладает киназной активностью.4.15. Оптимизация условий культивирования штаммов P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
